【佳學(xué)基因檢測】如何利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC)進(jìn)行遺傳病的基因矯正治療

佳學(xué)基因?qū)ёx

為了讓佳學(xué)基因及其他機(jī)構(gòu)檢出的遺傳病患者系統(tǒng)性地了解基因矯正的國際進(jìn)展，本文重點(diǎn)介紹了如何利誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)及位點(diǎn)特異性核酸酶 (SSN) 介導(dǎo)的基因組編輯工具的結(jié)合所進(jìn)行的基因矯正治療研究。iPSC所能維持的多能性不僅為基礎(chǔ)研究提供了充足、持續(xù)的細(xì)胞來源，也為人類疾病的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了載體。此外，快速發(fā)展的 SSN 基因矯正工具能夠有效地定制基因操作以揭示、改變基因功能，從而為在不久的將來可用于糾正先天性疾病的遺傳缺陷。iPSC 和 SSN 技術(shù)的結(jié)合還可以在體外重建完全模擬具有明確基因原因的、可不斷重復(fù)的體外人類疾病模型，并為細(xì)胞替代和精準(zhǔn)治療提供新的解決方案。

關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）、位點(diǎn)特異性核酸酶（SSN）、鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）、成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)系統(tǒng)9（Cas9）

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 技術(shù)

2006年與2007年，Takahashi博士與Yamanaka博士通過強(qiáng)制表達(dá)四種與多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子——Oct4、Klf4、Sox2與c-Myc，成功將小鼠及人類的體細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)。這些類似胚胎干細(xì)胞（ESC）的細(xì)胞被命名為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）。iPSC具備與ESC相似的特征，包括自我更新能力、正常核型、可分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞類型以及種系傳遞能力。由于兼具ESC樣特性與個(gè)體化制備體細(xì)胞的潛力，該技術(shù)迅速引起全球范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。

隨著研究的深入，iPSC的誘導(dǎo)效率已得到顯著提升，包括優(yōu)化培養(yǎng)條件、篩選最佳細(xì)胞來源、改進(jìn)載體設(shè)計(jì)，以及引入蛋白質(zhì)和小分子輔助重編程策略。值得一提的是，侯博士的研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了無需引入Yamanaka因子，僅通過化學(xué)誘導(dǎo)即可成功建立iPSC的新方法。目前，iPSC已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，并成為發(fā)育生物學(xué)研究、疾病模型構(gòu)建及藥物篩選的重要體外平臺(tái)（圖1）。

通過多能干細(xì)胞（PSC）進(jìn)行基因改變，不僅會(huì)從根本上提高研究人員在不同發(fā)育階段或三維類器官結(jié)構(gòu)中揭示細(xì)胞的功能及形態(tài)變化過程，控制和指導(dǎo)這些過程的基因表達(dá)模式、基因與與微環(huán)境調(diào)控動(dòng)態(tài)作用，還為功能性修復(fù)特定細(xì)胞的功能提供了驗(yàn)證平臺(tái)。佳學(xué)基因矯正團(tuán)隊(duì)在此重點(diǎn)介紹誘導(dǎo)性干細(xì)胞為載體的位點(diǎn)特異性基因矯正工具的 使用。
 

基因組編輯工具的開發(fā)：位點(diǎn)特異性核酸酶（SSN）應(yīng)用前的基因組修飾

以iPSC為載體的基因矯正主要采用兩種策略：隨機(jī)插入與位點(diǎn)特異性靶向修飾。在隨機(jī)插入方面，慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒是最常用的載體系統(tǒng)。另一種廣泛應(yīng)用的方法是采用具有隨機(jī)插入特性的轉(zhuǎn)座子工具，如Sleeping Beauty和piggyBac等。這些轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)座酶蛋白的介導(dǎo)，能夠?qū)啥藥в心┒酥貜?fù)序列的DNA片段隨機(jī)插入宿主基因組。與病毒載體相比，轉(zhuǎn)座子工具的優(yōu)勢在于可通過再次表達(dá)轉(zhuǎn)座酶將插入片段從基因組中切除，從而獲得無轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞克隆。

外源DNA片段通過插入iPSC基因組可實(shí)現(xiàn)多種應(yīng)用，包括構(gòu)建基因特異性報(bào)告系統(tǒng)及實(shí)現(xiàn)基因過表達(dá)。盡管這類方法操作便捷，但也存在明顯局限性。首先，隨機(jī)插入可能引發(fā)宿主基因組突變；其次，插入基因的表達(dá)水平往往與內(nèi)源基因的自然表達(dá)存在差異；此外，根據(jù)染色體整合位點(diǎn)的表觀遺傳特征，外源基因還可能遭遇基因沉默現(xiàn)象。

相比之下，位點(diǎn)特異性靶向插入策略能夠提供更高的表達(dá)穩(wěn)定性和基因操作精確性。目前大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚未完全解析，這限制了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法在基因功能研究中的應(yīng)用。而位點(diǎn)特異性靶向技術(shù)能夠有效克服這些缺陷，成為基因功能研究和基因治療的重要工具?；谕粗亟M（HR）的定點(diǎn)整合是實(shí)現(xiàn)特異性插入的傳統(tǒng)方法，該過程依賴于外源DNA兩端同源臂與基因組靶位點(diǎn)的自發(fā)重組。

同源重組技術(shù)已在小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）中廣泛應(yīng)用，成功構(gòu)建了多種基因敲入/敲除小鼠模型。在國際研究中，類似方法也被用于建立多種轉(zhuǎn)基因人類多能干細(xì)胞（hPSC）疾病模型。這些策略還成功構(gòu)建了諸如Oct4（多能性標(biāo)記）和Oligo2（神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記）等基因特異性報(bào)告系統(tǒng)，為細(xì)胞分化研究和特定譜系分離純化提供了重要工具。

盡管同源重組技術(shù)在mESC中成效顯著，但在hPSC中的應(yīng)用卻面臨挑戰(zhàn)。主要障礙在于hPSC對(duì)細(xì)胞分離操作極其敏感：大多數(shù)hPSC在分離過程中會(huì)因E-鈣黏蛋白連接中斷而引發(fā)細(xì)胞凋亡。這一特性不僅顯著降低DNA轉(zhuǎn)染或電穿孔效率，還嚴(yán)重影響獲得單細(xì)胞來源靶向hPSC系的成功率。最新研究表明，通過添加Y27632（一種Rho/ROCK信號(hào)通路抑制劑）可有效維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，抑制分離誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。此外，當(dāng)hPSC轉(zhuǎn)化為幼稚狀態(tài)時(shí)，這種細(xì)胞死亡現(xiàn)象也顯著減弱。幼稚態(tài)hPSC表現(xiàn)出與mESC相似的特征，包括獨(dú)特的細(xì)胞形態(tài)、生殖系標(biāo)記表達(dá)以及單細(xì)胞狀態(tài)下的高存活率，這些特性可能顯著提升hPSC的基因組編輯效率。同時(shí)，新開發(fā)的無飼養(yǎng)層化學(xué)成分確定培養(yǎng)基不僅能避免飼養(yǎng)層細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)移過程中的干擾，還通過提高擴(kuò)增細(xì)胞群體的均一性，從根本上加速了基因修飾hPSC的制備進(jìn)程。
 

如何開發(fā)位點(diǎn)特異性基因矯正工具？

圖2：基于位點(diǎn)特異性核酸酶（SSN）的基因組編輯工具。

(A) 鋅指核酸酶（ZFNs）：兩種鋅指核酸酶協(xié)同作用，通過每個(gè)鋅指識(shí)別 3 個(gè)堿基的方式實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性識(shí)別，并利用二聚化的 FokI 核酸酶在 DNA 上產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。

(B) 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）：兩種 TALEN 協(xié)同作用，通過每個(gè)重復(fù)可變二殘基（RVD）識(shí)別一個(gè)堿基的方式進(jìn)行位點(diǎn)特異性識(shí)別，并通過二聚化的 FokI 在 DNA 上產(chǎn)生 DSB。

(C–E) 基于 Cas9 的 SSN 系統(tǒng)：單導(dǎo) RNA（sgRNA）通過沃森-克里克堿基配對(duì)識(shí)別特定位點(diǎn)，并切割靶 DNA。

(C) 野生型 Cas9：在靶 DNA 上產(chǎn)生雙鏈斷裂；

(D) Cas9 單鏈核酸酶（Nickase）：在 PAM 相對(duì)的“向外（PAM-out）”或“向內(nèi)（PAM-in）”構(gòu)型下造成雙鏈單鏈切口；

(E) FokI-dCas9：利用二聚化的 FokI 結(jié)構(gòu)域在靶 DNA 上造成 DSB。

通過在患有遺傳性疾病個(gè)體的 DNA 上引入位點(diǎn)特異性的 DNA 斷裂，位點(diǎn)特異性核酸酶（SSN）能夠顯著提高同源重組（HR）介導(dǎo)的基因矯正效率。SSN 可激活細(xì)胞的 DNA 修復(fù)機(jī)制，主要包括同源定向修復(fù)（HDR）和非同源末端連接（NHEJ）。目前應(yīng)用最廣泛的 SSN 類型包括鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）以及成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR 相關(guān)系統(tǒng)（CRISPR/Cas9）（圖2）。

鋅指核酸酶（ZFN）是在 2005 年發(fā)展起來的一種基因編輯工具，其核心是將識(shí)別特定 DNA 序列的鋅指結(jié)構(gòu)域與 DNA 核酸酶結(jié)合而成。ZFN 的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域由多個(gè)串聯(lián)的鋅指單元構(gòu)成，每個(gè)鋅指通常識(shí)別三個(gè)核苷酸。為在特異性和效率之間取得平衡，通常采用 3 至 6 個(gè)鋅指單元作為最佳長度。ZFN 最常用的核酸酶域是 FokI 限制性內(nèi)切酶（圖2A）。目前，ZFN 已廣泛用于人類基因組編輯領(lǐng)域，其中一項(xiàng)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)是利用 ZFN 修飾趨化因子受體 CCR5，以期用于人類免疫缺陷病毒（HIV）的治療。

盡管 ZFN 是一種強(qiáng)有力的基因組編輯工具，但其作為序列特異性核酸酶（SSN）仍存在一些局限性。首先，鋅指結(jié)構(gòu)域與目標(biāo)核苷酸之間的最佳識(shí)別配對(duì)難以設(shè)計(jì)。構(gòu)建能夠與特定三核苷酸序列完全匹配的鋅指蛋白需要復(fù)雜的蛋白工程。其次，DNA 序列的上下游背景以及鋅指單元間的相互作用也會(huì)影響其結(jié)合效率。最后，較低的結(jié)合特異性可能引發(fā)脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致基因組的不準(zhǔn)確修飾。

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）是另一種廣泛應(yīng)用于序列特異性基因編輯的核酸酶，由 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶結(jié)構(gòu)域組成。TALEN 的 DNA 結(jié)合區(qū)來源于植物病原細(xì)菌黃單胞菌（Xanthomonas），由一系列重復(fù)單元構(gòu)成，每個(gè)單元含有 33～35 個(gè)氨基酸。重復(fù)序列中第 12 和第 13 位氨基酸組成重復(fù)可變二殘基（RVD），在識(shí)別特定 DNA 堿基中起關(guān)鍵作用。例如，Asn-Gly（NG）識(shí)別胸腺嘧啶，His-Asp（HD）識(shí)別胞嘧啶，Asn-Ile（NI）識(shí)別腺嘌呤，Asn-Asn（NN）識(shí)別鳥嘌呤。通過合理設(shè)計(jì)的連續(xù) RVD 序列，理論上 TALEN 可識(shí)別任意 DNA 目標(biāo)序列。DNA 被識(shí)別結(jié)合后，其 FokI 核酸酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo) DNA 雙鏈斷裂（DSB），從而引發(fā) HDR 或 NHEJ 修復(fù)反應(yīng)（圖2B）。

與ZFN相比，TALEN僅由四種類型的RVD（反向重復(fù)位點(diǎn)）覆蓋四個(gè)核苷酸。這一優(yōu)勢使其更容易生成用于基因靶向的TALEN靶向克隆。為了克服組裝連續(xù)重復(fù)殘基的困難，人們開發(fā)了許多TALEN組裝策略，包括金門法、白金門法和不依賴連接酶的克隆法（LIC）。
 

如何開發(fā)基于CRISPR/Cas9的基因矯正工具

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是化膿性鏈球菌中最常見的SSN，最早是在針對(duì)噬菌體感染的微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的（表1）。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的DNA識(shí)別和切割由三個(gè)組成部分組成：Cas核酸酶、CRISPR (cr)RNA和反式激活crRNA (tracrRNA) 。

表 1.鋅指核酸酶 (ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶 (TALEN) 和成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列 (CRISPR)/CRISPR 相關(guān)系統(tǒng) 9 (Cas9) 的位點(diǎn)特異性核酸酶 (SSN) 基因組編輯工具的比較。

Cas9 包含兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域 HNH 和 RuvC，用于形成 DSB 。對(duì)于 CRISPR/Cas 靶向，tracrRNA 促進(jìn) crRNA 成熟，并與加工后的 crRNA 結(jié)合形成小分子 (sg)RNA，用于靶向位點(diǎn)識(shí)別?；虬邢虻奶禺愋匀Q于靶向序列（也稱為原型間隔區(qū)）與 sgRNA 和原型間隔鄰近基序 (PAM) 的配對(duì)，后者與 Cas9 蛋白相互作用（圖 2C）。

越來越多的證據(jù)表明，CRISPR/Cas9 的脫靶效應(yīng)主要是由于 sgRNA 序列的高耐受性（最多 5 個(gè)錯(cuò)配）和 DSB 誘導(dǎo)的 NHEJ 修復(fù)所致。為了降低脫靶率并提高基因改造的準(zhǔn)確性，通過失活 Cas9 的 RuvC 核酸酶區(qū)域（RuvC 的 D10A 突變體）產(chǎn)生 Cas9 切口酶，以觸發(fā) DNA 單鏈斷裂并通過高保真堿基切除修復(fù)途徑進(jìn)行主要修復(fù)。具有反向 DNA 結(jié)合的配對(duì) Cas9 切口酶能夠制造雙鏈切口（圖2D ）。與野生型 Cas9 相比，這種改良的 Cas9 切口酶方法可以將靶向特異性提高 50-1500 倍以上，同時(shí)也降低了脫靶率。截短的 sgRNA 也可能降低 CRISPR/Cas9 的脫靶效應(yīng)。此外，用 FokI（稱為 fCas9）替換 Cas9，與人類細(xì)胞中的野生型 Cas9 相比，靶向特異性提高了 140 倍以上（圖2E）。

序列特異性核酸酶基因矯正在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用

對(duì)于基因治療，高效基因組靶向工具的開發(fā)為臨床應(yīng)用提供了可能性。修正后的細(xì)胞可能有助于移植治療。SSN 在臨床試驗(yàn)中的首次應(yīng)用是治療獲得性免疫缺陷綜合癥 (AIDS)。對(duì)于臨床前艾滋病治療，研究人員應(yīng)用基因組編輯工具在 HIV 輔助受體 CCR5 中產(chǎn)生突變，從而阻斷 HIV 感染和在 CD4 T 細(xì)胞上的增殖。修飾后的 T 細(xì)胞對(duì) HIV 感染具有抵抗力。基于積極的結(jié)果，2009 年啟動(dòng)了一項(xiàng) I 期研究，該研究使用 ZFN 修飾患者 CD4 T 細(xì)胞的 CCR5 進(jìn)行自體移植。共招募了 12 名患有慢性無病毒血癥 HIV 感染的患者，其中 6 名接受了 CCR5 編輯的 CD4 T 細(xì)胞自體移植治療。結(jié)果顯示，一名患者（該患者為 CCR5 delta 32 雜合子）的 HIV RNA 水平變得無法檢測到，并且大多數(shù)患者的 HIV RNA 水平都有所下降。這項(xiàng)試驗(yàn)證明了該策略的安全性和療效。值得注意的是，長期治療需要補(bǔ)充CCR5編輯的T細(xì)胞，以克服編輯T細(xì)胞的短期存活問題，或者可以使用造血干細(xì)胞作為下一個(gè)基因工程靶點(diǎn)，以提供長期T細(xì)胞。

hPSC在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用

PSC 的臨床試驗(yàn)已證明移植 PSC 衍生的分化細(xì)胞的安全性和有效性，包括治療年齡相關(guān)性黃斑變性 (AMD)、I 型糖尿病、帕金森病 (PD) 和心肌梗死 (表 2 ) 。

表 2.當(dāng)前基于人類多能干細(xì)胞 (hPSC) 的臨床試驗(yàn)列表。

首個(gè)使用人類胚胎干細(xì)胞（hESC）的臨床試驗(yàn)針對(duì)脊髓損傷，由Geron公司支持。該I期臨床試驗(yàn)于2010年10月啟動(dòng)。hESC衍生的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（GRNOPC1）被用于治療亞急性期脊髓損傷患者。出乎意料的是，Geron公司于2013年停止了該項(xiàng)目。然而，由于在AMD治療中成功使用hESC，Asterias公司于2016年重新啟動(dòng)了使用相同細(xì)胞類型的臨床試驗(yàn)。

針對(duì)I型糖尿病 (DM)，Viacyte公司于2014年10月啟動(dòng)了一項(xiàng)使用hESC衍生的胰腺前體細(xì)胞的I/II期臨床試驗(yàn)。I型糖尿病是由β胰島細(xì)胞的丟失引起的，患者需要終生注射胰島素。在這項(xiàng)試驗(yàn)中，研究人員使用了一種生物相容性膠囊來保護(hù)hESC衍生的胰腺前體細(xì)胞免受免疫排斥。動(dòng)物研究表明，這些被包裹的前體細(xì)胞能夠感知血糖水平并長期分泌胰島素，而不會(huì)形成畸胎瘤。然而，人體臨床試驗(yàn)的詳細(xì)結(jié)果仍在研究中。

人胚胎干細(xì)胞（hESC）衍生的心肌細(xì)胞具有治療心肌梗死的潛力。在非人靈長類動(dòng)物臨床前研究中，移植ESC衍生的心肌細(xì)胞可改善心肌梗死后的心臟功能，且未出現(xiàn)室性心律失常相關(guān)問題。在I期臨床試驗(yàn)中，hESC衍生的心臟祖細(xì)胞與纖維蛋白融合形成補(bǔ)片，然后將其移植到心臟受損區(qū)域。3個(gè)月后，心臟功能得到改善，未觀察到心律失常。

PSC 衍生細(xì)胞的功能改善首先在 AMD 研究中得到驗(yàn)證。AMD 是老年人最常見的失明類型，由視網(wǎng)膜色素上皮 (RPE) 的進(jìn)行性退化引起。Stargardt 黃斑營養(yǎng)不良 (SMD) 也是由 RPE 退化引起的，是一種由ABCA4、ELOVL4和PROM1突變引起的青少年發(fā)病的先天性疾病。AMD 和 SMD 患者的 I 期結(jié)果顯示，植入 ESC 衍生的 RPE 片后未觀察到腫瘤發(fā)生、免疫排斥和 RPE 增生。值得注意的是，對(duì)這些 I/II 期試驗(yàn)的長期觀察表明，移植的 RPE 細(xì)胞與感光細(xì)胞層整合，并顯著恢復(fù)了接受者的視力范圍。

日本已開展使用 iPSC 治療 AMD 的臨床試驗(yàn)。I 期試驗(yàn)于 2014 年 9 月在日本啟動(dòng)，由京都大學(xué) iPSC 研究與應(yīng)用中心、日本理化學(xué)研究所發(fā)育生物學(xué)中心 (RIKEN CDB) 和神戶市立醫(yī)療中心綜合醫(yī)院發(fā)起。這是世界上首個(gè)使用患者自身 iPSC 進(jìn)行自體移植的臨床試驗(yàn)。長期觀察未發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生或免疫排斥。此外，移植衍生的 RPE 片可改善患者的視力下降。將招募更多臨床患者來評(píng)估基于 iPSC 的細(xì)胞療法的安全性。

在上述臨床試驗(yàn)中，大多數(shù)應(yīng)用的 hESC 是同種異體的。同種異體移植僅可應(yīng)用于一些免疫特權(quán)部位，例如眼睛和脊髓。需要考慮一些特殊策略以避免免疫排斥。個(gè)性化 iPSC 系可以解決免疫相關(guān)問題。然而，生成和鑒定個(gè)性化臨床級(jí) iPSC 系既昂貴又耗時(shí)。與人類白細(xì)胞抗原 (HLA) 匹配的供體進(jìn)行同種異體移植是器官和骨髓移植的標(biāo)準(zhǔn)程序。建立和儲(chǔ)存少量 HLA 純合的超級(jí)供體 iPSC 系用于臨床應(yīng)用，而又沒有嚴(yán)重免疫排斥的缺點(diǎn)，是一種理想的策略（圖 3）。

基因組編輯工具拓展了基于iPSC的研究和疾病建模的應(yīng)用范圍

PSC 提供了一個(gè)體外模型，可以重現(xiàn)人類發(fā)育過程和細(xì)胞譜系分化，尤其是在早期胚胎階段。通過基因組修飾，研究人員可以描繪不同發(fā)育階段和 3D 類器官結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞命運(yùn)、基因表達(dá)時(shí)序和生態(tài)位環(huán)境調(diào)控。分化中的 PSC 還可以作為一個(gè)平臺(tái)，通過基因突變、缺失或替換在體外闡明單個(gè)或多個(gè)基因的功能及其生理作用（圖4）。

基因組編輯工具也為生成同基因型iPSC（用于精確疾病建模）提供了可行性。疾病型iPSC的特定突變可以通過基因組編輯工具人工制造或校正，從而生成同基因型疾病型iPSC，且在iPSC建立過程中不受細(xì)胞資源、隨機(jī)突變和表觀遺傳變異的干擾。這種通過SSN介導(dǎo)的基因校正或?qū)脒M(jìn)行的基因型/表型驗(yàn)證，鞏固了候選基因位點(diǎn)在患者來源的iPSC中的作用。

SSN 介導(dǎo)的患者來源 PSC 的基因校正應(yīng)用于帕金森病、尼曼匹克 C 型 (NPC) 病、鐮狀細(xì)胞病、β-地中海貧血、雷特綜合征、囊性纖維化和 α1-抗胰蛋白酶缺乏癥。CRISPR/Cas9 還用于校正毛細(xì)胞樣細(xì)胞缺乏癥中的 MYO15A 突變、骨髓增生異常綜合征中的 7q 染色體缺失和隱性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥 (RDEB) 中的 COL7A1突變。對(duì)于唐氏綜合征 21 三體的校正，使用 ZFN 編輯工具將可誘導(dǎo)的 XIST 轉(zhuǎn)基因引入 21 號(hào)染色體的 DYRK1A 基因座。這種修飾成功地沉默了21號(hào)染色體，并形成了21號(hào)染色體Barr小體，從而維持了基因表達(dá)的平衡。這兩種技術(shù)的結(jié)合，還使我們能夠生成針對(duì)杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）等大規(guī)模染色體異常疾病的基因校正的iPSC 。以上例子表明，SSN介導(dǎo)的基因校正的hPSC不僅提供了研究材料，而且還有可能作為自體移植的健康細(xì)胞來源。

SSN/hPSC 組合應(yīng)用的未來方向

將快速發(fā)展的基因組編輯工具與標(biāo)準(zhǔn)化的 hPSC 相結(jié)合，從根本上加速了人類發(fā)育研究、疾病建模、特定細(xì)胞示蹤/分離和臨床細(xì)胞治療的科學(xué)進(jìn)展。外源因子指導(dǎo)的PSC分化基本上遵循發(fā)育原則并反映早期胚胎形成，使 hPSC 成為研究人類早期發(fā)育的理想模型。鑒于 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的單基因敲除效率高，可以在 hPSC 及其衍生物中追蹤破壞基因的影響。研究 PSC 球形 3D 類器官培養(yǎng)中的突變效應(yīng)可以進(jìn)一步拓寬細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的影響范圍，例如細(xì)胞遷移、特殊環(huán)境和組織建構(gòu)。通過在 AAVS1 基因座穩(wěn)定表達(dá)誘導(dǎo)型 Cas9，類似于小鼠的 ROSA26 基因座，也可以實(shí)現(xiàn)在所需發(fā)育階段精確失活基因表達(dá)。這種 Cas9 內(nèi)切酶 (iCRISPR) 的組成型表達(dá)顯著提高了多基因失活的效率，并有助于在發(fā)育研究中同時(shí)探索直系同源基因。此外，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以進(jìn)一步改造為基因抑制因子或轉(zhuǎn)化為基因激活因子模塊，以描繪特定細(xì)胞類型中的調(diào)控復(fù)合物和基因功能 。這些高度進(jìn)化和多功能的基因編輯工具將極大地塑造 hPSC 作為人類早期發(fā)育研究的新平臺(tái)。

越來越多的證據(jù)表明，患者來源的 iPSC 中的家族性基因突變具有很高的穿透性，并且可以在 iPSC 衍生的靶細(xì)胞中忠實(shí)地重現(xiàn)疾病表型。疾病細(xì)胞病理學(xué)可以通過 TALEN 或 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 HR來糾正。鑒于 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的強(qiáng)大功能，研究人員可以通過在同源 iPSC 中使用合成寡核苷酸引入基因缺失或修復(fù)來改變疾病進(jìn)展和嚴(yán)重程度。風(fēng)險(xiǎn)因素的相互作用網(wǎng)絡(luò)也可以通過多重基因敲除來描繪。CRISPR/Cas9 和 PSC 的組合也提供了一個(gè)有價(jià)值的系統(tǒng)來研究常見但低風(fēng)險(xiǎn)的遺傳因素對(duì)非家族性和特發(fā)性疾病進(jìn)展的累積效應(yīng)，特別是對(duì)于神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥。近年來，全基因組 gRNA 文庫（全基因組 CRISPR 敲除篩選 [GeCKO]）已建立，用于解析多種癌癥細(xì)胞系和 hPSC 中的基因功能。這些創(chuàng)新方法將持續(xù)為多重打擊特發(fā)性疾病的病因提供基礎(chǔ)而全面的理解，為優(yōu)化患者的治療策略鋪平道路。

利用基因編輯工具制造 PSC 可以通過在細(xì)胞上引入特定標(biāo)簽并糾正 PSC 衍生細(xì)胞中的基因突變來擴(kuò)展精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用。在細(xì)胞特異性啟動(dòng)子下表達(dá)單個(gè)或多個(gè)特異性報(bào)告蛋白可以輔助細(xì)胞示蹤和細(xì)胞分選，以便進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞分析和移植。目前，臨床應(yīng)用于治療 AMD 的 PSC 衍生 RPE 片層是手動(dòng)分離的，未經(jīng)細(xì)胞分選。未來可能需要對(duì) PSC 衍生細(xì)胞進(jìn)行基因標(biāo)記，以富集所需的細(xì)胞群，例如多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞和造血干細(xì)胞，從而促進(jìn)追蹤細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞存活率和體內(nèi)腫瘤發(fā)生。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)憑借其簡便易用、成本低廉、高效且功能多樣的優(yōu)勢，成為人類基因治療的理想工具。多項(xiàng)基于基因組編輯和多能干細(xì)胞 (PSC) 技術(shù)的臨床試驗(yàn)也揭示了將 SSN/PSC 聯(lián)合移植療法應(yīng)用于現(xiàn)實(shí)世界的可能性。SSN/PSC 聯(lián)合技術(shù)不僅可用于治療遺傳疾病，還有望用于治療艾滋病毒 (HIV) 和癌癥。然而，要將 PSC 和基因組編輯工具應(yīng)用于臨床，未來仍需克服一些嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

大規(guī)模生產(chǎn)臨床級(jí)、高純度的工程特定細(xì)胞譜系是臨床應(yīng)用面臨的第一個(gè)挑戰(zhàn)。iPSC 的生成、特定細(xì)胞譜系的分化和基因組編輯非常耗時(shí)耗力，而且成本很高。尤其是在現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范 (cGMP) 規(guī)范下。為了簡化基于 SSN/PSC 的療法的流程，cGMP 級(jí) HLA iPSC 庫是未來十年的必要方法。對(duì)于臨床 hPSC 制備，需要能夠大規(guī)模擴(kuò)增高質(zhì)量 hPSC 的生物反應(yīng)器。此外，生成特定的細(xì)胞譜系高效分化實(shí)驗(yàn)方案是另一大挑戰(zhàn)。對(duì)于這個(gè)問題，基于熒光的細(xì)胞分選是純化特定細(xì)胞譜系的理想選擇。例如，表面標(biāo)志、Corin 和富含亮氨酸的重復(fù)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域 1 (LRTM1) 被用于多巴胺能神經(jīng)元前體純化。如前所述，SSN介導(dǎo)的細(xì)胞譜系特異性報(bào)告基因也可以為細(xì)胞純化提供理想的解決方案。

對(duì)于臨床治療，最受關(guān)注的問題是安全性。hPSC 固有的致瘤特性仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。對(duì)于臨床應(yīng)用，如何在移植前識(shí)別低致瘤風(fēng)險(xiǎn)的 iPSC 克隆并消除未分化的 iPSC 還有改進(jìn)的空間。此外，CRISPR/Cas9 的脫靶風(fēng)險(xiǎn)是另一個(gè)安全挑戰(zhàn)。對(duì)靶標(biāo)識(shí)別的高錯(cuò)配容忍度和強(qiáng)大的 DSB 活性會(huì)造成大量的脫靶突變，這極大地阻礙了基因治療的臨床應(yīng)用。使用 CRISPR/Cas9 對(duì)原代人 CD4+ T 細(xì)胞的研究顯示出良好的 CCR5 特異性靶向性、可忽略的脫靶突變和 HIV 抗性。然而，在三原核胚胎中測試 CRISPR/Cas9 進(jìn)行同源重組定向修復(fù)時(shí)，觀察到受精卵基因組中較高的非預(yù)期突變。盡管已經(jīng)開發(fā)出幾種方法來減少 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的脫靶缺陷，例如前面提到的 Cas9-nickase、dCas9-FokI 二聚體和截短的 sgRNA 寡聚體 ，但在胚胎或基于 PSC 的細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用之前，必須開發(fā)和驗(yàn)證具有高保真度和低不良突變的臨床級(jí)基因編輯工具。

最近，原始狀態(tài)hPSC的發(fā)現(xiàn)可能有利于原始生殖細(xì)胞（PGC）的分化。研究人員還應(yīng)用CRISPR/Cas9編輯人類胚胎基因組。然而，隨著技術(shù)的進(jìn)步，一些倫理爭議也隨之而來?；赟SN/PSC的技術(shù)不僅可能讓我們應(yīng)用于移植療法，還可能讓我們生成修飾的生殖細(xì)胞。這是一個(gè)重要的倫理問題，在將這些技術(shù)應(yīng)用于人類生殖系改造并影響我們的下一代之前，需要進(jìn)行詳細(xì)的討論。

如何看待用于基因矯正的干細(xì)胞治療？

綜上所述，iPSC 與 SSN 基因組靶向工具的結(jié)合，為疾病建模和移植治療提供了新的思路?；?SSN/PSC 的療法的致瘤性和脫靶問題或許在不久的將來得到克服，并有望成為常規(guī)臨床療法。未來的發(fā)展路線圖充滿挑戰(zhàn)，但也充滿希望。