遺傳疾病會(huì)導(dǎo)致許多復(fù)雜且難以治愈的病癥。編碼每個(gè)人的復(fù)雜性和許多疾病風(fēng)險(xiǎn)的 DNA 序列包含在線粒體基因組、核基因組和微生物宏基因組中。這些疾病的診斷已統(tǒng)一在下一代 DNA 測(cè)序的應(yīng)用上。然而，將特定的基因診斷轉(zhuǎn)化為有針對(duì)性的基因療法基因解碼基因檢測(cè)的一個(gè)中心目標(biāo)。迄今為止，基因療法已分為三大類：用新的外源基因組大量替換受影響的基因區(qū)域、非靶向添加外源遺傳物質(zhì)以補(bǔ)償基因突變所造成的功能缺失或異常，以及最近使用基因編輯直接糾正致病基因變異。診斷、治療和試劑輸送到每個(gè)基因區(qū)的通用方法將加速下一代治愈性基因療法的發(fā)展。遺傳病的基因矯正治療討論了線粒體、核和微生物宏基因組的結(jié)構(gòu)和變異性，以及針對(duì)每個(gè)區(qū)的基因診斷和基因療法的歷史發(fā)展和當(dāng)前實(shí)踐。

未來(lái)幾年將會(huì)怎樣徹底治療遺傳病關(guān)鍵詞

遺傳病、基因治療、基因編輯、基因診斷、臨床遺傳學(xué)

《人體基因序列變化與疾病表征》關(guān)于基因治療的介紹

遺傳病和治療的早期歷史

遺傳密碼的細(xì)微變化都可能導(dǎo)致極其嚴(yán)重的疾病和多種多樣的病癥。人類特征的遺傳性自古典時(shí)代就開(kāi)始被描述。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)史上，第一種已知的遺傳性疾病是尿黑酸尿癥，于 20 世紀(jì)初被發(fā)現(xiàn)并記錄入冊(cè)，從而讓人們認(rèn)識(shí)到先天性代謝缺陷。以人類遺傳密碼突變和改變?yōu)榛A(chǔ)的疾病是沉重的負(fù)擔(dān)，遺傳性疾病的發(fā)病率超過(guò) 5%，并是三分之二的流產(chǎn)的背后的原因。除了高度滲透的單基因疾病和大規(guī)模的染色體改變之外，許多常見(jiàn)疾病，如心血管疾病等都具有明確的遺傳基因原因。將遺傳疾病傳給下一代的可能性加劇了人們對(duì)這些疾病的恐懼。

20 世紀(jì) 40 年代末，在鐮狀細(xì)胞性貧血中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)遺傳變異，當(dāng)時(shí)人們發(fā)現(xiàn)電泳過(guò)程中發(fā)生了改變，這種改變與受檢患者的疾病狀態(tài)相對(duì)應(yīng)。隨后，在破譯了氨基酸的 DNA 密碼后，科學(xué)家認(rèn)識(shí)到 DNA 變異有可能導(dǎo)致酶的變異，從而導(dǎo)致疾病。在 DNA 測(cè)序問(wèn)世之前，唐氏綜合癥的病因是 1959 年發(fā)現(xiàn)的染色體異常 21 三體性，這是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的人類基因變異。從 20 世紀(jì) 60 年代開(kāi)始，可以通過(guò)生化方式篩查苯丙酮尿癥等遺傳代謝紊亂，而無(wú)需知道致病基因的位置或序列。 20 世紀(jì) 70 年代和 80 年代，桑格測(cè)序和重組分子生物學(xué)的出現(xiàn)首次使 DNA 序列測(cè)定變得廣泛可用。在隨后的幾十年里，直到 2003 年人類基因組計(jì)劃完成，基因圖譜聯(lián)盟付出了巨大的努力，才發(fā)現(xiàn)了一些最嚴(yán)重疾病的致病基因，包括 1983 年首次繪制的人類遺傳疾病亨廷頓氏病。隨著過(guò)去 20 年來(lái)外顯子組和全基因組測(cè)序成本的下降，基因診斷變得越來(lái)越可行，即使以前不被認(rèn)為是遺傳疾病的疾病實(shí)際上也是基因序列的變化引起的。《人體基因序列的變?nèi)伺c疾病表征》的編制是這些發(fā)展進(jìn)入臨床應(yīng)用的有利工具。

人類基因信息的組成

成年人的遺傳物質(zhì)可分為大小、遺傳性和多樣性各異的部分。線粒體基因組是最小的（僅 16.5 kb），但也是迄今為止最豐富的基因組，它是母系遺傳的，在人類群體中差異很小。細(xì)胞核中包含的傳統(tǒng)人類基因組要大得多，并且含有導(dǎo)致大多數(shù)傳統(tǒng)遺傳疾病的突變。細(xì)胞核和線粒體基因組在受孕時(shí)就已確定，盡管體細(xì)胞突變可能導(dǎo)致嵌合性疾病、癌癥甚至衰老。

更廣泛地說(shuō)，適應(yīng)性免疫受體庫(kù)是核基因組的一個(gè)獨(dú)特子集，微生物宏基因組僅在受孕后才確定，它們的遺傳復(fù)雜性（至少以獨(dú)特蛋白質(zhì)編碼序列的多樣性來(lái)衡量）遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其余的核基因組。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞經(jīng)歷體細(xì)胞重組，產(chǎn)生的獨(dú)特蛋白質(zhì)產(chǎn)物比核基因組的其他基因多幾個(gè)數(shù)量級(jí)，共同構(gòu)成適應(yīng)性免疫受體庫(kù)。最后，微生物組中的非人類細(xì)胞可能構(gòu)成所有基因組中最具活力和多樣性的部分，其中有一系列不同的物種，主要是細(xì)菌和病毒，占據(jù)著人類皮膚、性器官、胃腸道和呼吸道的結(jié)構(gòu)化生態(tài)位。適應(yīng)性免疫受體庫(kù)和微生物宏基因組在個(gè)體之間的差異都很大，越來(lái)越多的研究旨在了解免疫受體庫(kù)和微生物組中的遺傳變異如何導(dǎo)致疾病病理。

基因治療模式

任何一個(gè)環(huán)節(jié)的破壞，在許多情況下與環(huán)境因素相互作用，都可能導(dǎo)致不同種類的遺傳疾病。DNA密碼的簡(jiǎn)單性自 20 世紀(jì) 60 年代以來(lái)就吸引了研究人員和臨床醫(yī)生，他們希望通過(guò)糾正基因改變或基因治療來(lái)治愈疾病。自 20 世紀(jì) 70 年代初首次成功在人體細(xì)胞中異位表達(dá)外來(lái)基因以來(lái)，基因治療技術(shù)不斷發(fā)展，提高了基因轉(zhuǎn)移的效率、特異性和安全性。這些進(jìn)展促使美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的國(guó)家癌癥研究所于 20 世紀(jì) 80 年代末首次在人體上進(jìn)行基因治療試驗(yàn)，此前曾有過(guò)幾項(xiàng)測(cè)有受到監(jiān)管且最終未發(fā)表的基因治療嘗試。

20 世紀(jì) 90 年代，基因療法迅速發(fā)展，共啟動(dòng)了 500 多項(xiàng)試驗(yàn)。然而，21 世紀(jì)初，由于嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 (SCID) 和代謝性肝病的基因治療臨床試驗(yàn)中患者死亡，基因療法陷入停滯。21 世紀(jì)的第一個(gè) 10 年，基因轉(zhuǎn)移的安全性和有效性進(jìn)一步提高，最終導(dǎo)致新一代基因治療方法的復(fù)蘇。2017 年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 批準(zhǔn)了首個(gè)基于離體嵌合抗原受體 T 細(xì)胞 (CAR-T) 的 B 細(xì)胞惡性腫瘤基因療法，以及 2017 年首個(gè)針對(duì)萊伯氏先天性黑蒙所致視力喪失的體內(nèi)基因療法。

廣義上講，基因突變可以通過(guò)三種一般方式改變：對(duì)包含突變的整個(gè)基因組區(qū)域進(jìn)行批量替換或選擇、在基因組中非靶向插入額外的遺傳物質(zhì)以恢復(fù)足夠的功能來(lái)補(bǔ)償基因缺陷（非靶向添加），或僅對(duì)致病突變或基因改變進(jìn)行特異性校正（基因編輯）。批量替換是最基本的基因治療形式（圖1）。選擇性生殖以及最近的植入前診斷提供了預(yù)防性避免核基因組中種系突變的機(jī)會(huì)。線粒體替代療法和體外受精可以通過(guò)用“第三個(gè)父母”替換孩子的整個(gè)線粒體基因組來(lái)有效糾正線粒體突變。同樣，導(dǎo)致腫瘤的體細(xì)胞突變可以通過(guò)手術(shù)從體內(nèi)批量切除。通過(guò)糞便或微生物群落移植，微生物宏基因組的部分內(nèi)容越來(lái)越多地被治療性地改變。

然而，對(duì)于許多患者來(lái)說(shuō)，一種更可行的基因療法是非靶向性地引入新的遺傳物質(zhì)，以彌補(bǔ)突變序列丟失或有害的功能（圖2）。這種非靶向性遺傳物質(zhì)的添加在模型生物的生殖系轉(zhuǎn)基因中很常見(jiàn)，但重要的倫理問(wèn)題適當(dāng)?shù)刈柚沽巳祟惿诚档奶砑有曰虔煼?。在更具治療意義的體細(xì)胞中，從SV40到逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒以及現(xiàn)在最突出的腺相關(guān)病毒（AAV）假型，連續(xù)幾代病毒載體已經(jīng)能夠?qū)邮苄碌?、校正遺傳物質(zhì)的體內(nèi)細(xì)胞類型進(jìn)行更大的控制，最終導(dǎo)致FDA最近批準(zhǔn)了一種針對(duì)視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的特異性AAV2載體?；?γ 逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的獨(dú)立技術(shù)開(kāi)發(fā)路線已實(shí)現(xiàn)對(duì)造血干細(xì)胞 (HSC) 核基因組以及 T 細(xì)胞適應(yīng)性庫(kù)的有效體外操作，從而產(chǎn)生了同樣最近獲批的基于 CAR-T 的療法。

然而，血紅蛋白病（第一種通過(guò)分子學(xué)特征鑒定的遺傳?。┑幕蛑委煔v史揭示了非靶向基因添加的局限性。在早期試驗(yàn)中，鐮狀細(xì)胞性貧血和其他血紅蛋白病患者在將正確的偽血紅蛋白拷貝隨機(jī)添加到其 HSC 基因組中時(shí)，紅細(xì)胞生成過(guò)程中對(duì) α 和 β 血紅蛋白的嚴(yán)格調(diào)控阻止了紅細(xì)胞的形成。近年來(lái)，靶向 RNA 引導(dǎo)核酸酶（如 CRISPR/Cas9（成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/胱天蛋白酶-9））的快速發(fā)展，這些核酸酶以早期的鋅指核酸酶 (ZFN) 和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶 (TALEN) 靶向核酸酶為基礎(chǔ)，為治療此類遺傳病提供了一種簡(jiǎn)化的方法。通過(guò)在突變位點(diǎn)附近產(chǎn)生雙鏈 DNA 斷裂，這些核酸酶可以促使細(xì)胞通過(guò)模板修復(fù)來(lái)修復(fù)損傷，該修復(fù)基于單獨(dú)提供的包含所需序列的 DNA 模板。各種遞送技術(shù)可以將編碼核糖核蛋白 (RNA/蛋白質(zhì)) 核酸酶復(fù)合物 (RNP) 的 DNA 或重組 RNP 本身以及 DNA 模板運(yùn)送到體外和體內(nèi)越來(lái)越多的靶細(xì)胞群中，以糾正特定突變。這些基因編輯技術(shù)有望具有糾正基因組中幾乎所有突變的通用能力（圖 2）。

遺傳病困擾了一代又一代的家庭和醫(yī)生。每個(gè)人類基因組區(qū)段的獨(dú)特性質(zhì)都帶來(lái)了不同的診斷和治療挑戰(zhàn)。DNA 測(cè)序、將蛋白質(zhì)和 DNA 有效載荷體外和體內(nèi)遞送到特定人類細(xì)胞群、插入大量新遺傳物質(zhì)以及現(xiàn)在直接編輯內(nèi)源性基因位點(diǎn)的技術(shù)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。越來(lái)越多的診斷和治療方案可以針對(duì)所有人類基因組區(qū)段，而它們的進(jìn)一步發(fā)展為普遍治愈性基因療法帶來(lái)了希望（圖 3）。

線粒體基因組

線粒體基因組是人體中最小也是最豐富的遺傳信息集。保守估計(jì)，成年人體內(nèi)存在超過(guò) 1 千萬(wàn)億個(gè)線粒體拷貝，不同的人體組織每個(gè)細(xì)胞具有零到數(shù)千個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體平均有 1 到 2 個(gè) 16.5 kb 的線粒體基因組拷貝。人體內(nèi)的所有線粒體都是由重復(fù)的分裂循環(huán)產(chǎn)生的，這些分裂源自卵子發(fā)生過(guò)程中瓶頸最大的原始卵細(xì)胞中不到 10 個(gè)線粒體，最終是無(wú)性繁殖不間斷循環(huán)的后代，可追溯到第一個(gè)真核線粒體共生體。這種之前自由生活的祖先共生細(xì)菌可能擁有數(shù)千個(gè)基因。然而，在數(shù)億年的時(shí)間里，線粒體基因通過(guò)內(nèi)共生基因轉(zhuǎn)移相繼遷移到相對(duì)安全的核基因組中。剩下的 37 個(gè)線粒體基因編碼 22 個(gè)轉(zhuǎn)移 RNA、2 個(gè)線粒體核糖體 RNA 和 13 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，這些基因主要編碼電子傳遞鏈中量子連接的成員。這些基因占基因組的 90% 以上，其余部分由線粒體控制區(qū)的非編碼元件組成。

線粒體基因組對(duì)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換至關(guān)重要，因此在人類中高度保守，盡管在真核生物中，線粒體基因組的大小和基因含量差異很大。純化選擇推動(dòng)了線粒體基因組序列的保守性，因?yàn)榫€粒體 DNA 復(fù)制的錯(cuò)誤率比核復(fù)制的錯(cuò)誤率大約高 100 倍?？紤]到線粒體基因組的緊湊性，插入/缺失 (indel) 和重排等較大范圍的基因改變幾乎總是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。在卵子發(fā)生過(guò)程中，線粒體會(huì)經(jīng)歷強(qiáng)烈的純化選擇，大約五分之一的兒童具有新生線粒體突變，主要是同義突變。在體細(xì)胞中，線粒體之間連續(xù)的裂變和融合循環(huán)可能使未突變的線粒體基因組拷貝能夠進(jìn)行持續(xù)的純化選擇。線粒體在一生中大量分裂最終導(dǎo)致遺傳變化，成人線粒體中的體細(xì)胞嵌合體很容易被檢測(cè)到。老年人的線粒體相對(duì)于成人遺傳基因組具有數(shù)百種遺傳變化。

線粒體遺傳病

線粒體功能至關(guān)重要且普遍存在，因此線粒體基因組內(nèi)的突變會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生巨大且有害的影響。雖然大多數(shù)線粒體突變可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞無(wú)法存活，并在排卵前被淘汰，但每 5,000 個(gè)活產(chǎn)嬰兒中約有 1 個(gè)被診斷出患有肌病和神經(jīng)病等線粒體疾病。線粒體基因組中每個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的種系突變都與臨床疾病有關(guān)。更有推測(cè)稱，體細(xì)胞線粒體突變的積累與各種衰老疾病有關(guān)。

線粒體基因組是第一個(gè)被完全測(cè)序的人類遺傳區(qū)段，1981 年，桑格測(cè)序宣布確定了整個(gè)基因組。如今，全線粒體基因組測(cè)序可以通過(guò)下一代測(cè)序快速完成，盡管線粒體測(cè)序并不是新生兒篩查計(jì)劃的常見(jiàn)組成部分。最近，成人線粒體表現(xiàn)出的遺傳嵌合性甚至使人類克隆細(xì)胞群的譜系追蹤成為可能，這可能有助于診斷與年齡有關(guān)的疾病。

線粒體基因治療

線粒體具有獨(dú)特的遺傳性，受精后表型迅速出現(xiàn)，每個(gè)細(xì)胞中線粒體數(shù)量眾多，以及線粒體周圍的物理和化學(xué)障礙，使得針對(duì)線粒體基因組的基因治療特別具有挑戰(zhàn)性。同樣，線粒體基因的緊湊性使得基于非靶向插入新遺傳物質(zhì)（例如使用病毒載體）到線粒體基因組的策略不切實(shí)際。線粒體基因功能的中心地位意味著任何基因治療可能都必須糾正體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞，有利于生殖系糾正。

人類線粒體基因組體積小且序列高度保守，因此可以用供體的野生型線粒體大量替換含有已知遺傳疾病的卵母細(xì)胞線粒體，從而產(chǎn)生俗稱的三親嬰兒（圖 1a）。這種大量線粒體基因組替換實(shí)際上是反向進(jìn)行的：從供體的卵母細(xì)胞中取出核基因組，用來(lái)自預(yù)期母親的卵母細(xì)胞之一的細(xì)胞核替換，然后進(jìn)行體外受精。這種生殖系基因療法于 2016 年在英國(guó)獲批，用于治療遺傳性線粒體疾病，并可在由此產(chǎn)生的孩子中實(shí)現(xiàn)可遺傳的生殖系矯正。

然而，對(duì)于出生時(shí)就帶有新生線粒體突變的患者，種系大量線粒體置換只是他們自己孩子的一種選擇。在體細(xì)胞中糾正線粒體突變，特別是在足夠多的細(xì)胞和組織中糾正以達(dá)到臨床效果，是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)（圖 2a）。在某些情況下，可以通過(guò)使用非靶向病毒載體將線粒體基因整合到核基因組中，這一過(guò)程反映了線粒體基因的進(jìn)化核運(yùn)動(dòng)。例如，在萊伯遺傳性視神經(jīng)病變 (LHON) 中，這是一種由 NADH 泛醌氧化還原酶亞基（包括 ND4）突變引起的線粒體疾病，導(dǎo)致青年期出現(xiàn)急性視力喪失，將校正的ND4基因拷貝插入核中可使一些人類患者的視力改善。通過(guò)使用經(jīng)過(guò)改造的 AAV 衣殼（該衣殼經(jīng)過(guò)改造后含有內(nèi)源性線粒體靶向序列），已證明可以將遺傳物質(zhì)非靶向地直接添加到線粒體中（盡管不是直接添加到線粒體基因組中）。將含有ND4（導(dǎo)致 LHON 急性視力喪失的致病基因）校正拷貝的線粒體靶向序列改造的 AAV 病毒注射到患病小鼠的眼睛中，同樣可以導(dǎo)致視力改善。

靶向核酸酶（如 CRISPR/Cas9）可實(shí)現(xiàn)線粒體基因組的直接基因編輯，盡管尚不清楚微同源介導(dǎo)或同源定向修復(fù) (HDR) 是否在線粒體中常見(jiàn)。更直接的是，當(dāng)突變僅影響細(xì)胞中的一部分線粒體時(shí)，受影響的線粒體基因組的靶向切割和線性化可導(dǎo)致突變線粒體相對(duì)于健康線粒體的相對(duì)丟失，正如使用 TALEN 在體外所證明的那樣。然而，總體而言，線粒體基因療法面臨著巨大的挑戰(zhàn)，即如何有效地將基因編輯試劑體內(nèi)遞送到足夠多的體細(xì)胞中的線粒體基質(zhì)中以實(shí)現(xiàn)臨床益處。

線粒體基因組包含真核生命起源之初基本共生事件的活體遺跡，除成熟紅細(xì)胞外，在人體所有細(xì)胞中均有多個(gè)副本。其剩余基因在細(xì)胞能量轉(zhuǎn)移中起著核心作用，其中的罕見(jiàn)突變僅影響約 0.02% 的活產(chǎn)，會(huì)導(dǎo)致衰弱性疾病。涉及大量替換受影響卵母細(xì)胞線粒體的生殖系基因療法可能是治療線粒體遺傳疾病的有效方法，盡管僅限于后代。針對(duì)線粒體基因組的體細(xì)胞基因療法尚處于早期開(kāi)發(fā)階段，但它們面臨著巨大的物理和生物學(xué)障礙。相比之下，核基因的生殖系編輯在生物學(xué)和倫理上要復(fù)雜得多，而核基因組的體細(xì)胞基因療法則迅速普及。

核基因組

經(jīng)典的人類基因組或核基因組與較小的線粒體基因組具有更大的規(guī)模和復(fù)雜性，對(duì)診斷和基因治療提出了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。人類核基因組含有大約 30 億個(gè)堿基對(duì)，分為 22 條常染色體和 XX 或 XY 性染色體各兩個(gè)拷貝，每組從父母雙方遺傳一組。只有約 2% 的基因組直接編碼大約 20,000 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中的 1 個(gè)，盡管非編碼元件、著絲粒和端粒等結(jié)構(gòu)元件、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等調(diào)控元件以及微小 RNA 和長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 等功能性 RNA 元件構(gòu)成了非蛋白質(zhì)編碼基因組空間的很大一部分。此外，三聯(lián)體重復(fù)、短散在核元件 (SINE) 和長(zhǎng)散在核元件 (LINE) 等重復(fù)和自私遺傳元件占人類基因組內(nèi)容的一半以上。成人體內(nèi)約有 30 萬(wàn)億個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞都擁有一個(gè)二倍體核基因組拷貝，無(wú)核紅細(xì)胞、某些多核肌細(xì)胞和破骨細(xì)胞以及單倍體配子除外。平均而言，兩個(gè)不相關(guān)的人類基因組相差約 0.1%，其中五分之四的差異是由于個(gè)體差異造成的，其余五分之一的差異是由于人類群體之間的差異造成的。

種系遺傳疾病

人類基因組以每年 5 到 10 個(gè)基因變化的速度進(jìn)化。人類 DNA 聚合酶與校對(duì)酶相結(jié)合，總錯(cuò)誤率約為每復(fù)制 100 億個(gè) bp出現(xiàn)1 個(gè) 錯(cuò)誤的bp，在卵母細(xì)胞受精前約 22 輪分裂以及精子細(xì)胞數(shù)百輪分裂（隨父親年齡而變化）過(guò)程中會(huì)累積錯(cuò)誤。小突變和插入/缺失并不是生殖系遺傳變化的唯一類別，DNA 復(fù)制和細(xì)胞分裂中的錯(cuò)誤可導(dǎo)致重復(fù)擴(kuò)增、大量缺失、染色體易位以及常染色體和性染色體非整倍體。然而，在配子形成和受精后，存在著廣泛的選擇壓力，估計(jì)有 10-40% 的受精胚胎無(wú)法植入，總體而言，40-60% 的受精妊娠無(wú)法活產(chǎn)。例如，在 22 條常染色體中，只有 21 號(hào)染色體的非整倍性（導(dǎo)致唐氏綜合征）與長(zhǎng)壽相容，而任何其他常染色體的非整倍性在胚胎形成期間或出生后不久都是致命的?？傮w而言，每個(gè)人類新生兒在新受精胚胎中平均含有 10-20 個(gè)來(lái)自母體的新生突變和 25-75 個(gè)來(lái)自父體的新生突變，這些突變有可能發(fā)生在功能性蛋白質(zhì)編碼或非編碼序列中。除了新生突變之外，每個(gè)新生兒還遺傳有大約 100 個(gè)基因的種系功能喪失單等位基因突變，甚至估計(jì)有 20 個(gè)基因的雙等位基因功能喪失突變。

出生后出現(xiàn)的遺傳病通常會(huì)影響神經(jīng)、免疫和代謝系統(tǒng)，而這些系統(tǒng)在子宮內(nèi)的支持性環(huán)境中基本上不受選擇壓力。在 20,000 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，超過(guò) 4,000 個(gè)基因的突變已被確定為導(dǎo)致特定人類遺傳病的病因。大約 3,000 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因是人類細(xì)胞系所必需的，這些基因的功能喪失突變可能與配子發(fā)生或早期胚胎發(fā)育不相容。對(duì)人類種群規(guī)模和遺傳多樣性的估計(jì)預(yù)測(cè)，全球人類種群中已經(jīng)存在與生命相容的蛋白質(zhì)編碼核基因組中所有可能的單堿基對(duì)變化 。對(duì)單蛋白遺傳病的基因型-表型關(guān)系的完整分類是一個(gè)可能的長(zhǎng)期目標(biāo)。

然而，核基因組的復(fù)雜性遠(yuǎn)超其蛋白質(zhì)產(chǎn)物，越來(lái)越多的非編碼調(diào)控和功能性 RNA 元件突變也被確定為導(dǎo)致遺傳疾病的原因。此外，2000 年代末和 2010 年代進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS) 已將許多遺傳基因變異與常見(jiàn)疾病聯(lián)系起來(lái)，盡管 GWAS 的一個(gè)標(biāo)志性發(fā)現(xiàn)是每種常見(jiàn)遺傳基因變異對(duì)常見(jiàn)疾病風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)相對(duì)較小。

在 21 世紀(jì)第二代測(cè)序技術(shù)和人類參考基因組問(wèn)世之前，人們通過(guò)對(duì)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (RFLP) 和其他可追蹤的遺傳變異區(qū)域進(jìn)行仔細(xì)的基因圖譜繪制，發(fā)現(xiàn)了亨廷頓氏病和肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等疾病的致病遺傳變異 ，甚至基于 RFLP 實(shí)現(xiàn)了鐮狀細(xì)胞性貧血和地中海貧血等疾病的診斷檢測(cè)。如今，臨床上通過(guò)多種檢測(cè)方法進(jìn)行種系遺傳診斷。導(dǎo)致生化缺陷的常見(jiàn)遺傳疾病通常無(wú)需測(cè)序即可通過(guò)化學(xué)方法診斷，例如新生兒苯丙酮尿癥和半乳糖血癥。傳統(tǒng)核型可以診斷大規(guī)模染色體異常，單核苷酸多態(tài)性微陣列可以檢測(cè)小規(guī)模（但仍有數(shù)千個(gè)堿基）的缺失。靶向測(cè)序面板（通過(guò)外顯子組測(cè)序與確認(rèn)性桑格測(cè)序或直接通過(guò)桑格測(cè)序進(jìn)行）是具有一致臨床表型的遺傳疾病的主要診斷方法。

對(duì)于沒(méi)有明確描述過(guò)遺傳綜合征的患者，對(duì)患病個(gè)體和父母雙方進(jìn)行診斷性全外顯子組測(cè)序以及日益流行的全基因組測(cè)序，可以揭示多達(dá) 40% 患者的致病基因改變。大規(guī)模染色體異?？梢栽诔錾皬奶ケP組織或羊水中診斷出來(lái)，這些樣本也可用于 DNA 測(cè)序。對(duì)于臨床或遺傳上懷疑患有遺傳病的個(gè)體，母親血液中的循環(huán)胎兒 DNA 提供了一種侵入性較小的遺傳診斷方式。輔助生殖技術(shù)的進(jìn)步甚至可以通過(guò)在體外受精后細(xì)胞分裂的最早階段去除極少量的細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)基因測(cè)序和診斷。這些植入前診斷，加上更傳統(tǒng)的父母攜帶者檢測(cè)，可以準(zhǔn)確診斷出特定核遺傳疾病的存在或風(fēng)險(xiǎn)。

在許多情況下，即使在生命的早期階段，生殖細(xì)胞的遺傳病也是可以診斷的。治療性糾正這些信息內(nèi)容中的錯(cuò)誤可以在生殖細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，也可以在生命后期在受影響的體細(xì)胞組織中進(jìn)行。在每種情況下，基因治療策略可以分為三類：大量替換整個(gè)受影響的核基因組，即使三十億個(gè)堿基對(duì)中只有一個(gè)堿基對(duì)可能致?。环前邢蛱砑油庠催z傳物質(zhì)以補(bǔ)償遺傳錯(cuò)誤；以及通過(guò)基因編輯直接糾正致病突變。

種系基因治療

從廣義上講，患有生殖系遺傳病的患者或未來(lái)患者受影響的核基因組可通過(guò)生殖決策預(yù)先解決。在已知某種遺傳病攜帶者率高的社區(qū)，如攜帶 HEXA 基因突變（泰-薩克斯病的病因）的阿什肯納茲猶太人社區(qū)，有效的社區(qū)篩查和生殖咨詢已將篩查人群中患泰-薩克斯病的兒童比例降至基本為零。同樣，基于基因診斷的生殖決策使個(gè)別夫婦能夠通過(guò)使用精子或卵子捐獻(xiàn)者的體外受精，以及通過(guò)傳統(tǒng)的收養(yǎng)來(lái)防止遺傳疾病的傳播。從某種意義上說(shuō)，所有這些都是解決生殖系遺傳突變的批量核基因組策略（圖 1b）。

直接向人類生殖系中添加新的遺傳物質(zhì)，或?qū)?nèi)源性生殖系序列進(jìn)行基因編輯，在倫理上是一個(gè)重大的舉措，截至 2020 年，科學(xué)、醫(yī)學(xué)、倫理、宗教和政府界普遍認(rèn)為這是不恰當(dāng)?shù)模▓D 2b）。2018 年，首次公開(kāi)宣布人類生殖系基因編輯嘗試，引起了科學(xué)界的強(qiáng)烈憤慨 ，凸顯了政府和科學(xué)界進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)督和監(jiān)管的必要性。

體細(xì)胞遺傳疾病

受精時(shí)存在的突變會(huì)被身體的每個(gè)細(xì)胞遺傳，但基因復(fù)制錯(cuò)誤會(huì)在每個(gè)體細(xì)胞分裂周期中繼續(xù)發(fā)生，并由于紫外線、輻射和誘變劑暴露等環(huán)境因素而不斷積累。成熟體細(xì)胞類型的細(xì)胞分裂次數(shù)與該細(xì)胞類型發(fā)展成腫瘤的傾向之間存在線性相關(guān)性，這突顯了不同組織最終體細(xì)胞中遺傳錯(cuò)誤積累的不同。腸上皮細(xì)胞等細(xì)胞類型的干細(xì)胞可以經(jīng)歷數(shù)百輪分裂，與分裂次數(shù)低的成骨細(xì)胞或神經(jīng)元相比，它們更容易引發(fā)腫瘤。由于一個(gè)細(xì)胞中的突變會(huì)遺傳給未來(lái)從該細(xì)胞衍生的所有體細(xì)胞，因此胚胎發(fā)生早期的變化可能導(dǎo)致大片組織甚至整個(gè)器官出現(xiàn)有時(shí)有害的突變。最終，由于這種體細(xì)胞嵌合性，成年人體內(nèi)的兩個(gè)不同體細(xì)胞可能會(huì)有數(shù)千個(gè)堿基對(duì)的差異。

早期發(fā)育過(guò)程中的體細(xì)胞突變可導(dǎo)致許多與生殖系突變相同的遺傳疾病，其嚴(yán)重程度取決于嵌合程度和受影響的終末器官。例如，在由OTC基因的 X 連鎖隱性突變引起的鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥中，患有生殖系突變的患者如果不進(jìn)行肝移植，很少能在童年時(shí)期存活下來(lái)，但患有體細(xì)胞突變的患者，即使是那些影響大量受影響細(xì)胞類型（肝細(xì)胞）的患者，通過(guò)改變飲食可以過(guò)上相對(duì)正常的生活。體細(xì)胞突變經(jīng)歷許多與生殖系相同的選擇壓力，有強(qiáng)有力的證據(jù)表明錯(cuò)義突變會(huì)被選擇。然而，增加細(xì)胞分裂率的體細(xì)胞突變，尤其是在分化較低的干細(xì)胞群體中，可以沿著明確的突變路徑進(jìn)行，直至致癌轉(zhuǎn)化。就結(jié)腸癌而言，APC早期驅(qū)動(dòng)突變的獲得，隨后是增殖增加、KRAS 突變，最后是 p53 突變，這反過(guò)來(lái)又進(jìn)一步降低 DNA 復(fù)制保真度，引發(fā)一系列 DNA 變化，最終導(dǎo)致癌癥。更廣泛地說(shuō)，正常組織中體細(xì)胞突變?cè)谏^(guò)程中的積累，除了增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)外，還可能導(dǎo)致與年齡相關(guān)的功能下降。

DNA 測(cè)序通量的進(jìn)步，特別是高覆蓋率的全外顯子組和基因組的進(jìn)步，同樣增強(qiáng)了診斷體細(xì)胞致癌和其他有害遺傳變化的能力。自 20 世紀(jì) 80 年代發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因（如p53）和致癌基因（如KRAS）的體細(xì)胞突變以來(lái)，越來(lái)越多的致癌突變被收錄入《人體基因序列變化與疾病表征》數(shù)據(jù)庫(kù)。隨著 2018 年癌癥基因組圖譜測(cè)序項(xiàng)目的結(jié)束，估計(jì)有 300 個(gè)癌癥驅(qū)動(dòng)基因中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)突變 ，只剩下極少數(shù)突變需要通過(guò)更大規(guī)模的癌癥隊(duì)列測(cè)序來(lái)識(shí)別 。腫瘤、癌前病變和健康組織的臨床體細(xì)胞基因組測(cè)序正變得越來(lái)越常規(guī)，單突變面板正被多基因、外顯子組或全基因組測(cè)序所取代 。隨著進(jìn)一步的發(fā)展，利用無(wú)細(xì)胞DNA測(cè)序等侵入性較小的方法檢測(cè)早期腫瘤的DNA序列和表觀遺傳改變，甚至可以將體細(xì)胞基因組測(cè)序擴(kuò)展到大規(guī)模人群篩查應(yīng)用。

體細(xì)胞遺傳療法

針對(duì)體細(xì)胞基因組的基因療法可以通過(guò)特定的內(nèi)源性基因編輯和糾正恢復(fù)正常序列來(lái)糾正遺傳缺陷，非靶向地向基因組添加外源性遺傳物質(zhì)以補(bǔ)償突變，或大量替換體細(xì)胞基因組。體細(xì)胞基因組中的基因療法進(jìn)一步區(qū)分為僅需要替換、添加或糾正目標(biāo)組織（例如肝臟、肌肉或眼睛的組織）中的遺傳信息。此外，對(duì)于可以在體外培養(yǎng)的某些細(xì)胞類型（例如 HSC 和 T 細(xì)胞），這些基因療法可以在體外進(jìn)行，并將改變的細(xì)胞返回到患者體內(nèi)。但是，對(duì)于大多數(shù)目標(biāo)組織，體細(xì)胞基因療法必須克服在體內(nèi)遞送遺傳物質(zhì)和編輯試劑的挑戰(zhàn)，同時(shí)避免被患者自身的免疫系統(tǒng)排斥。

與生殖系療法中操作單個(gè)細(xì)胞相比，由于需要進(jìn)行基因改變的細(xì)胞數(shù)量巨大，因此批量替換體細(xì)胞基因組中的基因改變同樣困難。對(duì)于某些疾病，例如由PKD1、PKD2、PKD3和PKHD1基因突變引起的多囊腎病，通過(guò)移植更換患病的腎臟可有效去除致病遺傳物質(zhì)，但肝臟等其他器官仍然受到影響。同樣，當(dāng)腫瘤可手術(shù)時(shí)，從某種意義上說(shuō)，手術(shù)可以批量去除突變的體細(xì)胞基因組。通過(guò)避免已知的環(huán)境誘變?cè)纯蓽p少體細(xì)胞突變負(fù)荷。

體細(xì)胞基因組的非靶向添加

最早以此命名的基因療法是基于對(duì)體外培養(yǎng)的免疫細(xì)胞（特別是 T 細(xì)胞和 HSC）的核基因組進(jìn)行非靶向添加（圖 2b ）。20 世紀(jì) 80年代初，人們成功改造了第一種來(lái)自莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV) 的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，這預(yù)示了后來(lái)來(lái)自人類免疫缺陷病毒的慢病毒載體的出現(xiàn)，大片段的數(shù)千堿基的新 DNA 可以被偽隨機(jī)地引入這些細(xì)胞類型中。首次基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)使用 MMLV 衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒將異源腫瘤壞死因子 (TNF)-α 表達(dá)盒添加到從轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者腫瘤中分離并在體外擴(kuò)增的 T 細(xì)胞中。

雖然與早期未經(jīng)修改的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞試驗(yàn)相比，這項(xiàng)首次試驗(yàn)并未帶來(lái)臨床益處，但它引發(fā)了隨后 30 年間大量 T 細(xì)胞和 HSC 的體外添加基因療法。在首次 T 細(xì)胞試驗(yàn)后，在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥 (SCID) 兒童體外培養(yǎng)的 HSC 中非靶向添加腺苷脫氨酶的正確拷貝，在某些情況下，這些早期基因治療患者獲得了持久且迄今為止終身的治愈。這些體外添加逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)已擴(kuò)展到當(dāng)前基于 CAR-T 的療法中合成 DNA 序列的非靶向整合。

在體外基因添加療法發(fā)展的同時(shí)，病毒載體具有靶向特定人體組織類型和遞送外源 DNA 的雙重功能，已實(shí)現(xiàn)向多種體細(xì)胞類型進(jìn)行體內(nèi)基因添加（圖 2b）。肝臟肝細(xì)胞一直是活躍的靶組織，作為蛋白質(zhì)生成工廠，用于添加缺失或功能失調(diào)的血液因子。在由循環(huán)凝血因子 VIII 和 IX 缺乏引起的血友病 A 和 B 病例中，向肝細(xì)胞體內(nèi)添加新的因子 VIII 和 IX 基因已實(shí)現(xiàn)治愈性基因療法 。從腺病毒到現(xiàn)代工程化的 AAV 血清型和假型，多代病毒遞送系統(tǒng)已大大提高了體內(nèi)體細(xì)胞基因療法的功效、特異性和免疫安全性。由于視網(wǎng)膜具有獨(dú)特的易接近位置和免疫特權(quán)組織狀態(tài)，因此也經(jīng)歷了大量的基因治療試驗(yàn)。首個(gè)獲得 FDA 批準(zhǔn)的體內(nèi)基因療法確實(shí)將RPE65基因的異源拷貝添加到萊伯氏先天性黑蒙患者的視網(wǎng)膜細(xì)胞中，從而帶來(lái)持久的視力改善。

然而，非靶向添加基因療法受到各種限制。從功能上講，目前常用的 AAV 載體的基因攜帶能力僅限于約 4.5 kb，太小，無(wú)法編碼表達(dá)大型內(nèi)源性蛋白質(zhì)正確拷貝，例如在極端情況下，編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白所需的 10 kb 以上的互補(bǔ) DNA，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白在肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者中發(fā)生突變。同樣，早期試驗(yàn)試圖將正確版本的 α 或 β 血紅蛋白插入鐮狀細(xì)胞性貧血和地中海貧血患者的 HSC，由于紅細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中對(duì)血紅蛋白表達(dá)的調(diào)控不當(dāng)，導(dǎo)致紅細(xì)胞生成失敗。

更重要的是，本世紀(jì)初基因治療臨床試驗(yàn)中患者的死亡凸顯了偽隨機(jī)整合病毒載體的眾多安全問(wèn)題。首先，1999 年，一名患有鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥的患者死亡，該患者因體細(xì)胞嵌合而患有輕度疾病，死因是病毒載體在體內(nèi)將基因貨物遞送到患者肝細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。此外，對(duì)新近糾正的、因此被識(shí)別為非自身的內(nèi)源性基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)可能會(huì)限制杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等疾病的治療效果。早期 X 連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥 (SCID) 臨床試驗(yàn)中，在離體編輯 HSC 時(shí)出現(xiàn)了一系列白血病，揭示了引入非靶向遺傳元件（包括驅(qū)動(dòng)異源治療基因的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子）會(huì)帶來(lái)意想不到的后果 。病毒載體拷貝整合到致癌基因（如LMO2）附近，在最初成功治療多年后，會(huì)誘發(fā)致癌轉(zhuǎn)化。最后，一名類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者在成功接受抗 TNF 誘餌受體基因治療后，因組織胞漿菌病真菌感染而死亡，這一事件凸顯了偽隨機(jī)添加基因產(chǎn)物調(diào)控不當(dāng)?shù)臐撛谖ｋU(xiǎn) ；基因治療的靶向毒性可能會(huì)抑制患者發(fā)起有效免疫反應(yīng)的能力。

體細(xì)胞基因組中的基因編輯

基于糾正目標(biāo)體細(xì)胞類型中的個(gè)體致病突變的基因療法可以通過(guò)非靶向基因添加克服許多此類挑戰(zhàn)。所有經(jīng)歷細(xì)胞分裂的細(xì)胞都會(huì)嘗試通過(guò)多種 DNA 修復(fù)途徑修復(fù) DNA 復(fù)制錯(cuò)誤，包括 HDR，其中一條染色體上的突變可以通過(guò)結(jié)合另一條染色體上的同源區(qū)域并進(jìn)行模板修復(fù)來(lái)糾正。20 世紀(jì) 80 年代，HDR 能夠在人類細(xì)胞系中的特定、用戶定義的位點(diǎn)無(wú)瘢痕地整合外源 DNA 序列，盡管最初的效率極低。雖然這對(duì)于轉(zhuǎn)基因模型生物的產(chǎn)生至關(guān)重要，但人類細(xì)胞的體內(nèi)或體外治療應(yīng)用仍有待開(kāi)發(fā)出可靶向的 DNA 核酸酶，這種核酸酶可以在鄰近基因校正的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈 DNA 斷裂。

這些靶向雙鏈斷裂將人類細(xì)胞中 HDR 的效率提高了許多個(gè)數(shù)量級(jí)，并在 21 世紀(jì)初促成了首次使用 ZFN 進(jìn)行靶向基因編輯試驗(yàn)，以糾正IL2RG中導(dǎo)致 SCID 的突變。21 世紀(jì) 10 年代中期，RNA 引導(dǎo)核酸酶（最突出的是 CRISPR/Cas9）的發(fā)現(xiàn)和快速發(fā)展，使這些基因編輯試劑的開(kāi)發(fā)變得更加簡(jiǎn)單和便宜。與含有同源臂的校正外源 DNA 模板配對(duì)，可以快速設(shè)計(jì)和合成用于在人類核基因組的幾乎任何位點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)源基因編輯的試劑。甚至可以將 DNA 和蛋白質(zhì)成分組合成單組分系統(tǒng)，使用 Cas9-逆轉(zhuǎn)錄酶融合蛋白以及帶有延伸 RNA 序列的引導(dǎo) RNA，該延伸 RNA 序列包含預(yù)期的突變校正而不是同源 DNA 。該過(guò)程允許模板修復(fù)直接跟隨核酸酶識(shí)別，而無(wú)需額外的 DNA 序列，從而可能簡(jiǎn)化試劑輸送。

事實(shí)上，將基因編輯試劑遞送到靶細(xì)胞中的挑戰(zhàn)是更廣泛地應(yīng)用體細(xì)胞矯正基因療法的一大障礙。對(duì)于可以在體外培養(yǎng)的 HSC 和 T 細(xì)胞群，電穿孔等物理遞送方法能夠?qū)⒑颂呛说鞍祝ɡ?Cas9-引導(dǎo) RNA 復(fù)合物）和 DNA HDR 模板穩(wěn)健地遞送到靶細(xì)胞中 。在 HSC 中，針對(duì) β-血紅蛋白中鐮狀細(xì)胞突變的 Cas9 RNPs 的電穿孔，再加上使用 AAV6 載體遞送含有正確序列的 HDR 模板，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)鐮狀細(xì)胞性貧血（第一種分子描述的遺傳病）的致病突變的穩(wěn)健校正。這些校正后的 HSC 能夠完全分化，并且至關(guān)重要的是，進(jìn)行紅細(xì)胞生成。輕松生成新的編輯試劑以針對(duì)其他突變可能使該策略廣泛應(yīng)用于造血遺傳疾病。除了HSC之外，遺傳病的基因矯正治療還展示了如何使用類似的RNP電穿孔策略（而不是使用非病毒DNA）來(lái)直接糾正分化T細(xì)胞群（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）中的致病突變。

通過(guò)基因編輯修復(fù)內(nèi)源性遺傳序列也為體內(nèi)體細(xì)胞基因治療提供了新途徑。值得注意的是，在肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等疾病中，蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)于常用的病毒載體來(lái)說(shuō)太大，基因編輯試劑已被設(shè)計(jì)并成功遞送至小鼠模型，以及許多其他快速發(fā)展的臨床前體內(nèi)療法。體內(nèi)基因編輯進(jìn)一步凸顯了編輯試劑遞送的挑戰(zhàn)，因?yàn)楸仨殞⒋笮偷鞍踪|(zhì)核酸酶或編碼它們的 DNA 序列和矯正 DNA HDR 模板遞送至目標(biāo)體細(xì)胞組織。在少數(shù)情況下，可能出現(xiàn)僅通過(guò)基因切割而非模板修復(fù)即可實(shí)現(xiàn)治愈性治療的創(chuàng)造性解決方案。更小的可靶向核酸酶、單組分模板修復(fù)系統(tǒng)以及最重要的遞送技術(shù)的普遍改進(jìn)的開(kāi)發(fā)，為加速體細(xì)胞組織的體內(nèi)矯正基因治療帶來(lái)了巨大希望。

操控其他基因組

適應(yīng)性免疫受體庫(kù)

體細(xì)胞亞群除了核基因組外，還包含一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞，即適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞，它們?cè)谑茉泻笸ㄟ^(guò)體細(xì)胞重組產(chǎn)生新的抗原受體基因產(chǎn)物。年輕成人的免疫受體庫(kù)保守估計(jì)包含大約 10 11 個(gè)獨(dú)特的抗原受體，產(chǎn)生的單個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物比核基因組多出近 6 個(gè)數(shù)量級(jí)，不過(guò)庫(kù)的多樣性會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而下降 。T 細(xì)胞庫(kù)中 T 細(xì)胞受體 (TCR) 基因的存在或缺失可導(dǎo)致 1 型糖尿病和多發(fā)性硬化癥等疾病的發(fā)展，而自身反應(yīng)性 B 細(xì)胞受體 (BCR)則是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力和許多其他疾病的基礎(chǔ)。在相反的情況下，由于防范自身免疫或癌癥微環(huán)境中所謂的免疫編輯的調(diào)節(jié)機(jī)制，適應(yīng)性免疫受體庫(kù)有時(shí)缺乏潛在有用的 TCR 和 BCR，例如對(duì)液體和實(shí)體腫瘤有反應(yīng)的 TCR 和 BCR 。

可以通過(guò)大量替換整個(gè)庫(kù)或選擇性引入所需的 TCR 和 BCR 序列來(lái)對(duì)核基因組的適應(yīng)性免疫受體庫(kù)子集進(jìn)行遺傳操作。這些細(xì)胞中的大多數(shù)對(duì)放射敏感，因此可以通過(guò)自體或同種異體骨髓移植大量替換該基因組區(qū)室，這種方法已成功用于治療嚴(yán)重的自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性硬化癥 。特異性引入所需抗原受體可以靶向難以接種疫苗的抗原，如內(nèi)源性肽或掩蔽致病表位。自 2000 年代以來(lái)，病毒載體已在臨床上用于在原代人類 T 細(xì)胞的偽隨機(jī)基因組位點(diǎn)添加新的 TCR 基因。更廣泛地說(shuō)，結(jié)合抗體結(jié)合特性和 TCR 及共刺激分子信號(hào)傳導(dǎo)特性的 CAR 已被設(shè)計(jì)用于將 T 細(xì)胞重定向到也在癌癥上表達(dá)的自身抗原，如 B 細(xì)胞標(biāo)志物 CD19。

理論上，遺傳病的基因矯正治療可以設(shè)想未來(lái)的個(gè)性化治療，其基礎(chǔ)是將針對(duì)各種微生物或腫瘤抗原的抗原受體引入癌癥和傳染病患者的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞，或者以消除自身免疫性疾病患者體內(nèi)現(xiàn)有的針對(duì)自身抗原的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞為目標(biāo)。由于免疫受體庫(kù)的多樣性，這些想法的實(shí)際應(yīng)用具有挑戰(zhàn)性。鑒定對(duì)特定微生物或腫瘤起作用或?qū)μ囟ㄗ陨砜乖l(fā)生反應(yīng)的 TCR、BCR 或合成抗原受體基因仍然是一項(xiàng)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。鑒于目前人們對(duì) T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞抗原受體測(cè)序的巨大興趣和進(jìn)展，隨著足夠大的受體序列數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，這些挑戰(zhàn)有可能被克服。

微生物宏基因組

與線粒體和核基因組相比，人體內(nèi)蛋白質(zhì)家族多樣性最復(fù)雜的遺傳區(qū)室不是位于人體細(xì)胞內(nèi)，而是位于普遍存在的微生物群的宏基因組中。在人體組織中，成年人的微生物組包含來(lái)自大約 1,000 個(gè)獨(dú)特物種的超過(guò) 30 萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。不同的解剖位置具有不同的微生物組，并且根據(jù)部位、個(gè)體、時(shí)間和疾病狀態(tài)的不同，其多樣性程度也不同。平均每個(gè)細(xì)菌含有大約 3,000 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，單個(gè)人的整體微生物宏基因組可能包含大約一百萬(wàn)種獨(dú)特的基因產(chǎn)物。微生物宏基因組直到出生后才獲得，最初主要通過(guò)陰道傳遞、皮膚接觸和母乳喂養(yǎng)從母親那里遺傳。人類宏基因組的遺傳內(nèi)容在個(gè)體生命中和個(gè)體之間也比線粒體或核基因組更加多樣化。兩個(gè)隨機(jī)個(gè)體之間的微生物組可能存在超過(guò)一半的內(nèi)容差異（盡管在共享當(dāng)?shù)丨h(huán)境和飲食的同居人類中差異要小得多），而兩個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體之間的核遺傳內(nèi)容差異平均約為 0.1%。

傳統(tǒng)上，通過(guò)直接離體培養(yǎng)生物體或引入動(dòng)物宿主后檢測(cè)特定疾病來(lái)測(cè)量微生物組中特定致病微生物成分的存在與否。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等核酸特異性方法提供了更高的速度和靈活性，可以從可能擁有致病毒素基因的細(xì)菌物種中差異地檢測(cè)出這些基因。在更大規(guī)模上，16S 核糖體測(cè)序利用核糖體 RNA 的進(jìn)化保守性來(lái)直接測(cè)量微生物物種多樣性。16S 宏基因組測(cè)序最早始于 20 世紀(jì) 70 年代，后來(lái)通過(guò)與下一代測(cè)序相結(jié)合而得到擴(kuò)展，可快速確定人類微生物組的屬級(jí)多樣性。隨著測(cè)序成本的進(jìn)一步下降，宏基因組 DNA 樣本的大量片段化和通過(guò)計(jì)算組裝成物種特異性基因組和轉(zhuǎn)錄組，越來(lái)越多地允許對(duì)宏基因組區(qū)室進(jìn)行確定性采樣。

由于分子技術(shù)有助于識(shí)別不可培養(yǎng)的微生物，研究人員假設(shè)人類微生物組的改變與各種疾病的發(fā)展有關(guān)，這提出了操縱微生物組及其遺傳產(chǎn)物可能成為這些疾病的治療策略的可能性。到目前為止，臨床上唯一廣泛應(yīng)用的針對(duì)微生物組的治療方法是，在艱難梭菌誘發(fā)的偽膜性結(jié)腸炎中，通過(guò)糞便移植大量替換耗盡的微生物組。也有人提出，炎癥性腸病和其他炎癥和代謝性疾病中存在微生物組異常。菌群失調(diào)的廣義概念認(rèn)為，微生物組的性質(zhì)和多樣性的改變是這些疾病的誘發(fā)因素。為了使用遺傳方法恢復(fù)多樣性，有必要識(shí)別受到干擾的特定生物，以及可能導(dǎo)致疾病的生物基因。

可以很容易地使細(xì)菌在基因組外質(zhì)粒上表達(dá)外源基因，但由于體內(nèi)不存在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室選擇壓力，可能需要直接編輯細(xì)菌基因組以維持表達(dá)。通過(guò)噬菌體載體或整合質(zhì)粒進(jìn)行非靶向基因添加以及使用 CRISPR/Cas9 和其他可靶向工具進(jìn)行基因編輯，已經(jīng)能夠在人類微生物組的細(xì)菌物種中在體外發(fā)生大規(guī)模可遺傳改變。在常見(jiàn)的核遺傳疾病苯丙酮尿癥中，一種經(jīng)過(guò)基因改造可遺傳表達(dá)苯丙氨酸代謝酶的大腸桿菌Nissle 菌株在口服后表現(xiàn)出持續(xù)植入小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物微生物組并改善血液苯丙氨酸水平。體外編輯的微生物群落可以像未編輯的治療性細(xì)菌物種一樣引入正常菌群。通過(guò)針對(duì)工程菌株進(jìn)行有針對(duì)性的營(yíng)養(yǎng)支持，可進(jìn)一步增強(qiáng)植入效果。

隨著將基因編輯試劑靶向體內(nèi)特定微生物物種的遞送方法的改進(jìn)，這些治療性微生物基因改變最終可能在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)，類似于針對(duì)體細(xì)胞基因組和適應(yīng)性免疫受體庫(kù)的體內(nèi)基因療法的目標(biāo)。噬菌體顯著的物種特異性使得能夠遞送針對(duì)致病菌株甚至特定抗生素耐藥質(zhì)粒進(jìn)行破壞的基因編輯試劑，并且可能還允許添加基因療法。無(wú)論是通過(guò)大量更換微生物組、對(duì)特定細(xì)菌物種進(jìn)行體外或體內(nèi)基因編輯，還是重現(xiàn)對(duì)正常菌群的生理暴露，改變多樣化人類宏基因組的遺傳內(nèi)容都可能為未來(lái)的基因療法研究提供有希望的途徑。

關(guān)于遺傳病的基因治療策略的共識(shí)性意見(jiàn)

人類的主要遺傳區(qū)室在基因組大小、復(fù)雜性、遺傳性和多樣性方面各不相同。線粒體和核基因組中的種系突變常常導(dǎo)致發(fā)育障礙，盡管核基因組的巨大規(guī)模確保了數(shù)千種已發(fā)現(xiàn)的單基因疾病存在于不同的環(huán)境中。核基因組中體細(xì)胞突變的積累是癌癥發(fā)展的基礎(chǔ)，而線粒體中的體細(xì)胞突變可能導(dǎo)致衰老。更廣泛地說(shuō)，微生物宏基因組主要在出生后發(fā)展，其特點(diǎn)是人類之間的多樣性更大，并且在生命過(guò)程中變化很大。下一代 DNA 測(cè)序的進(jìn)展使線粒體測(cè)序、臨床外顯子組和全基因組測(cè)序以及 16S 和無(wú)偏微生物測(cè)序得到廣泛應(yīng)用。

這些測(cè)序方法揭示的基因變異是基因療法的可糾正目標(biāo)。通過(guò)使用現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)，包括線粒體替代療法和植入前診斷，可以批量處理整個(gè)基因組區(qū)室，例如線粒體和核基因組。附加體細(xì)胞基因療法始于病毒載體的開(kāi)發(fā)，用于感染可在體外培養(yǎng)的人體細(xì)胞，例如 T 細(xì)胞，并迅速發(fā)展到包括具有特定組織向性的病毒假型的體內(nèi)應(yīng)用。最近，CRISPR/Cas9 和相關(guān)可靶向基因編輯應(yīng)用的重大進(jìn)展，其中特定的致病突變或基因在其內(nèi)源性位點(diǎn)得到糾正，為更精細(xì)的體外和體內(nèi)基因療法拓展了視野。

總體而言，過(guò)去 20 年來(lái) DNA 測(cè)序成本的大幅下降加速了遺傳病的診斷。與這些診斷進(jìn)展相呼應(yīng)的是，2010 年代靶向基因編輯的意外快速發(fā)展，現(xiàn)在已使設(shè)計(jì)和測(cè)試用于糾正遺傳變化的特定治療試劑變得直接且易于獲取?；虔煼◤V泛應(yīng)用面臨的最大持續(xù)挑戰(zhàn)之一在于通用平臺(tái)，用于將可定制的基因編輯試劑遞送到患者特定遺傳病的目標(biāo)細(xì)胞類型和基因組區(qū)室中（圖 3）。除了直接糾正遺傳病外，快速發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)癌癥和自身免疫等疾病細(xì)胞功能的合成遺傳回路的新方法有望在工程體細(xì)胞中進(jìn)一步應(yīng)用基因治療。人類遺傳區(qū)室中的遺傳病越來(lái)越容易被診斷出來(lái)，針對(duì)每個(gè)區(qū)的下一代基因治療平臺(tái)將提供靈活和個(gè)性化的治療方案。

要點(diǎn)總結(jié)

1. 人類含有不同的遺傳部分：線粒體基因組；核基因組（包括專門細(xì)胞中的適應(yīng)性免疫受體庫(kù)）和微生物宏基因組。

2. 針對(duì)每個(gè)領(lǐng)域的基因療法基于三大類：受影響基因組的批量替換或選擇、非靶向添加新的遺傳信息以彌補(bǔ)遺傳錯(cuò)誤，以及直接基因編輯以糾正致病的遺傳變異。

3. 線粒體和核基因組在受孕時(shí)就已確定，并且在整個(gè)生命過(guò)程中保持一致，但體細(xì)胞突變的積累和適應(yīng)性免疫受體庫(kù)除外。遺傳病主要由突變引起。

4. 通過(guò)新一代測(cè)序診斷遺傳病和設(shè)計(jì)矯正基因治療試劑目前正被廣泛采用。將基因添加或基因編輯試劑與通用遞送平臺(tái)配對(duì)以針對(duì)體內(nèi)特定體細(xì)胞類型的特定遺傳區(qū)室仍然是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。