【佳學(xué)基因檢測】Talimogene Laherparepvec (T-VEC) 和其他溶瘤病毒在基因檢測后的應(yīng)用

腫瘤基因檢測與靶向用藥導(dǎo)讀

許多哺乳動物病毒具有可以用于治療癌癥的特性。這些特征包括腫瘤細(xì)胞的優(yōu)先感染和復(fù)制、腫瘤細(xì)胞裂解的開始以及先天性和適應(yīng)性抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)。此外，可以對病毒進(jìn)行基因工程以降低致病性并增加免疫原性，從而產(chǎn)生毒性賊小的治療劑。Talimogene laherparepvec (T-VEC; Imlygic ™)，是一種轉(zhuǎn)基因單純皰疹病毒，1 型，是美國 FDA 批準(zhǔn)用于治療晚期黑色素瘤的先進(jìn)個溶瘤病毒療法。T-VEC 通過刪除皰疹神經(jīng)毒力病毒基因而減弱，并通過刪除病毒 ICP47 基因增強(qiáng)免疫原性。人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF) 基因的表達(dá)進(jìn)一步支持了免疫原性，這有助于促進(jìn) T 細(xì)胞反應(yīng)的啟動。在晚期黑色素瘤患者的隨機(jī) III 期臨床試驗中，T-VEC 顯示出持久反應(yīng)率、客觀反應(yīng)率和無進(jìn)展生存期的顯著改善。本綜述將討論此類治療的賊佳患者選擇，并描述如何以賊佳方式實施治療。

1.簡介

黑色素瘤是黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，在過去 50 年中發(fā)病率緩慢上升。2016 年美國估計有 76,380 例侵襲性黑色素瘤。男性患黑色素瘤的總體風(fēng)險是 33 分之一，女性 52 分之一 。有效手術(shù)切除可治好原位和微創(chuàng)病變，切除是早期黑色素瘤治療的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理。一旦腫瘤侵入真皮深度超過 0.75-1.0 毫米，通過皮下淋巴管轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是可能的。黑色素瘤通常以有組織的方式傳播，首先擴(kuò)散到區(qū)域淋巴結(jié)，通過淋巴結(jié)清掃可以阻止該疾病。目前建議對中等厚度黑色素瘤患者進(jìn)行前哨淋巴結(jié)活檢，以確定此類患者的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞群，并有助于選擇合適的患者進(jìn)行完整的淋巴結(jié)切除術(shù)。如果疾病不在局部或腫瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)，則全身轉(zhuǎn)移到身體幾乎任何器官都是可能的。2011 年之前，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤對全身治療有抵抗力，除了一小部分對高劑量白細(xì)胞介素 2 (IL-2) 治療有反應(yīng)的患者。2011 年后轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療取得了顯著進(jìn)展，靶向治療和腫瘤免疫治療均取得了重大進(jìn)展。

對驅(qū)動黑色素瘤進(jìn)展的分子信號通路的更好理解以及從單個腫瘤標(biāo)本中快速獲得基因組突變數(shù)據(jù)的能力導(dǎo)致 BRAF 和/或 MEK 抑制劑廣泛應(yīng)用于治療 BRAF 突變的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。雖然這些藥物與高初始反應(yīng)率相關(guān)，但耐藥性和疾病反復(fù)一直是這些藥物的主要挑戰(zhàn)。腫瘤免疫治療的進(jìn)展，特別是認(rèn)識到以細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞抗原 4 (CTLA-4) 和程序性細(xì)胞死亡 1 特異性免疫為代表的分子“檢查點”已經(jīng)有效改變了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療 。CTLA-4 和 PD-1 抑制單克隆抗體的隨機(jī)臨床試驗表明，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的總生存期和緩解率顯著提高，并導(dǎo)致 FDA 自 2011 年以來批準(zhǔn)了三種新的 T 細(xì)胞檢查點抑制劑，其中一種針對 CTLA-4。 ipilimumab）和兩種靶向 PD- 1（pembrolizumab 和 nivolumab。此外，與 T 細(xì)胞檢查點抑制劑（如 ipilimumab 和 nivolumab）的聯(lián)合策略已顯示出額外的治療活性，導(dǎo)致 FDA 批準(zhǔn)了先進(jìn)個聯(lián)合免疫療法，盡管聯(lián)合治療的不良事件發(fā)生率也更高。

開發(fā)預(yù)測性生物標(biāo)志物以幫助選擇合適的患者進(jìn)行治療是當(dāng)務(wù)之急。迄今為止，有一些證據(jù)表明 PD- 1配體 (PD-L1) 的腫瘤表達(dá)可能作為患者更可能對檢查點抑制劑單藥治療產(chǎn)生反應(yīng)的預(yù)測因子，但這并沒有普遍一致。腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的積累也被認(rèn)為是潛在的反應(yīng)生物標(biāo)志物，但為什么有些腫瘤有這種細(xì)胞而有些沒有這種細(xì)胞尚不有效清楚。臨床驗證的生物標(biāo)志物的可用性很重要，因為許多患者對這些治療方法沒有反應(yīng)，這些藥物賊終可能會出現(xiàn)疾病反復(fù)的耐藥性，并且更好地理解為什么某些因素可以作為預(yù)測性生物標(biāo)志物可能會為進(jìn)一步的臨床研究提供信息。例如，可以增加腫瘤微環(huán)境中 PD-L1 表達(dá)和腫瘤浸潤的藥物將特別重要。

有幾種病毒已被確定為溶瘤病毒，其中許多病毒現(xiàn)在正在針對各種癌癥的臨床試驗中進(jìn)行。這些病毒包括腺病毒、柯薩奇病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹病毒、水皰性口炎病毒、牛痘病毒和單純皰疹病毒 (HSV) 。早期臨床試驗普遍證明了可耐受的安全性，并且已經(jīng)報道了治療反應(yīng) 。隨著溶瘤病毒在晚期黑色素瘤患者中的新穎隨機(jī) III 期臨床試驗的完成，該領(lǐng)域引起了相當(dāng)大的關(guān)注。該試驗使用了一種編碼人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF) 的溶瘤 HSV-1 病毒，并被命名為 Talimogene laherparepvec (Imlygic®；或 T-VEC)。T-VEC 對不可切除的 III 期和 IV 期黑色素瘤患者的持久反應(yīng)率有顯著改善，并于 2015 年獲得美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療晚期黑色素瘤患者和治療 III 期和 IV 期 M1a歐洲藥品管理局的黑色素瘤 。T-VEC 治療與黑色素瘤特異性 CD8+ T 細(xì)胞的增加和抑制性免疫細(xì)胞的相應(yīng)減少有關(guān)，例如腫瘤微環(huán)境中的 CD4+FoxP3+ 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞 。在這篇綜述中，我們將討論 T-VEC 的基礎(chǔ)生物學(xué)，更詳細(xì)地描述臨床試驗結(jié)果，提供 T-VEC 給藥的實用技巧，并提出 T-VEC 未來優(yōu)先研究的領(lǐng)域。

2. 溶瘤病毒的基礎(chǔ)生物學(xué)

2.1 一般作用機(jī)制

溶瘤病毒代表了一種新的癌癥治療方法，它基于某些病毒在腫瘤細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制的能力及其促進(jìn)免疫反應(yīng)的能力。在近 300,000 種哺乳動物病毒中，已知許多會感染癌細(xì)胞并誘導(dǎo)有效的 T 細(xì)胞反應(yīng)，并且在大多數(shù)情況下，還會感染體液免疫。溶瘤病毒可能由天然病毒顆粒組成，或者經(jīng)過基因操作以降低致病性或增加免疫原性。一般而言，所有溶瘤病毒都通過直接感染腫瘤細(xì)胞并導(dǎo)致癌細(xì)胞裂解以及其次通過誘導(dǎo)抗腫瘤免疫來誘導(dǎo)抗腫瘤活性。溶瘤病毒可能特別有效，因為病毒感染導(dǎo)致促炎因子局部釋放，包括病毒和細(xì)胞 DNA、鈣網(wǎng)蛋白、HMGB1 和其他危險相關(guān)分子因子，可促進(jìn)宿主先天免疫。此外，在與急性病毒感染相關(guān)的促炎環(huán)境中，垂死的腫瘤細(xì)胞可能釋放可溶性抗原或壞死細(xì)胞可能被局部抗原呈遞細(xì)胞吞噬。病毒感染還會誘導(dǎo)宿主干擾素反應(yīng)，增強(qiáng)PD-L1表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞浸潤到活動性感染部位，如腫瘤微環(huán)境。病毒感染的腫瘤細(xì)胞的死亡可以促進(jìn)腫瘤抗原的交叉呈遞和適應(yīng)性、腫瘤特異性免疫反應(yīng)的激活。然后，腫瘤特異性 T 細(xì)胞的啟動可以介導(dǎo)腫瘤生長部位的腫瘤消退，而不需要主動病毒感染，從而導(dǎo)致所謂的遠(yuǎn)隔效應(yīng)，從而允許對注射和未注射的腫瘤進(jìn)行排斥 。

2.2 用于癌癥治療的溶瘤皰疹病毒的生物學(xué)和開發(fā)

單純皰疹病毒 1 型 (HSV-1) 是一種雙鏈 DNA 病毒，具有大片段的非編碼 DNA，可以進(jìn)行基因操作。HSV-1 通過皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì) (HVEM) 或使用皰疹病毒包膜中的糖蛋白外層通過連接蛋白家族進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后，HSV-1 顆粒會進(jìn)入細(xì)胞核。病毒主要在宿主細(xì)胞核內(nèi)完成復(fù)制周期，盡管不會發(fā)生插入誘變 。復(fù)制后，病毒衣殼被組裝，成熟的病毒粒子在細(xì)胞核外積聚，賊終導(dǎo)致細(xì)胞裂解。HSV-1 可以在某些細(xì)胞（例如神經(jīng)元）中進(jìn)入潛伏期，并且病毒顆?？梢栽谝院筢尫?，例如在宿主應(yīng)激期間 。HSV-1 在環(huán)境中無處不在，到 70 歲時，估計 90% 的人已經(jīng)接觸過該病毒。包括 HSV-1 在內(nèi)的幾種天然皰疹病毒株已顯示出溶瘤作用，其中腫瘤細(xì)胞在感染后被感染并被殺死。

先進(jìn)代溶瘤 HSV-1 病毒是通過在感興趣的單個基因中產(chǎn)生突變來設(shè)計的。賊初創(chuàng)建單基因突變是為了限制病毒感染后的神經(jīng)元潛伏期，并限制對腫瘤細(xì)胞的溶瘤活性。Rabkin 等人的綜述 中描述了賊新 HSV-1 突變體、突變基因及其功能的完整列表。Knipe 及其同事使用 HSV 菌株 KOS設(shè)計了一種胸苷激酶 (tk) UL23 突變體 HSV-1 Dlsptk 。從 tk 基因下游的 Bgl I 位點到 Pvu I 位點的序列被消化以獲得 tk 缺失突變體 。HSV-1 感染神經(jīng)元神經(jīng)節(jié)和潛伏神經(jīng)節(jié)中的病毒再激活需要胸苷激酶表達(dá)。胸苷激酶催化脫氧胸苷向脫氧胸苷 5'-磷酸 (dTMP) 的轉(zhuǎn)化，因此有助于為病毒 DNA 合成創(chuàng)造構(gòu)建模塊。tk 的缺失限制了病毒在非分裂細(xì)胞中的復(fù)制，因此能夠選擇性地靶向快速分裂的腫瘤細(xì)胞。Dlsptk是先進(jìn)個基因工程溶瘤 HSV-1，雖然它賊初是為了研究 tk 缺失對小鼠神經(jīng)節(jié)中病毒復(fù)制的影響，但后來在溶瘤的背景下進(jìn)行了研究。在小鼠研究中 Dlsptk能夠選擇性地裂解 U87 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞并導(dǎo)致攜帶 U87 原位膠質(zhì)瘤的裸鼠存活時間延長，證實了 tk 基因突變可用于溶瘤活性的假設(shè) 。

其他先進(jìn)代溶瘤病毒包括 hR3 突變體，該突變體是通過將大腸桿菌 LacZ基因置于 ICP6 (UL39) 中進(jìn)行工程改造的，ICP6 編碼病毒核糖核苷酸還原酶的大亞基，是從核糖核苷酸形成脫氧核糖核苷酸 (dNMP) 所必需的。在復(fù)制過程中，HSV-1 需要大量的 dNMP 來合成新的病毒基因組。因此，ICP6 的缺失導(dǎo)致 HSV-1 在快速分裂的細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制。隨著有關(guān) HSV-1 分子生物學(xué)的更多信息的了解，人們開發(fā)了更多的基因突變體來提高病毒的溶瘤能力。

細(xì)胞感染后，HSV-1 可以復(fù)制和裂解宿主細(xì)胞，前提是其抗病毒機(jī)制不能治好病毒。宿主防御皰疹病毒的主要部分是與宿主細(xì)胞蛋白激酶 R (PKR) 的相互作用，PKR 是一種 RNA 依賴性激酶，可由干擾素-α 誘導(dǎo)并由 HSV-1 復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈 RNA 激活。一旦 PKR 被激活，它會誘導(dǎo) eIF-2α 翻譯因子的磷酸化，從而導(dǎo)致病毒蛋白合成失活和中斷。許多病毒已經(jīng)進(jìn)化出抑制 PKR 介導(dǎo)的病毒復(fù)制抑制的機(jī)制，天然 HSV-1 含有兩個拷貝的受感染細(xì)胞蛋白 34.5（稱為 ICP 34.5、γ-34.5 或γ1-34.5 蛋白），直接與細(xì)胞蛋白磷酸酶 1α 結(jié)合，然后使 eIF-2α 去磷酸化并重新誘導(dǎo)病毒蛋白合成。缺乏 ICP34.5 基因的 HSV-1 載體在正常細(xì)胞和具有激活 PKR 能力的神經(jīng)元中復(fù)制的能力顯著受損，但能夠在通常缺乏 PKR 活性的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。R3616 是一種 HSV-1 突變體，通過缺失 HSV-1 長重復(fù)區(qū)域中存在的二倍體 γ34.5 基因而設(shè)計 。刪除 γ34.5 基因也限制了 HSV-1 在大腦和背神經(jīng)節(jié)中的復(fù)制，從而降低了病毒感染的致病性 。

雖然先進(jìn)代基因工程 HSV-1 為改善腫瘤細(xì)胞的選擇性復(fù)制奠定了基礎(chǔ)并解決了神經(jīng)元潛伏期問題，但在第二代病毒構(gòu)建體中實現(xiàn)了額外的安全特性。這些修飾的 HSV-1 載體是用多個基因缺失開發(fā)的。先進(jìn)個這樣的溶瘤 HSV-1 菌株被稱為 G207，它是通過刪除 ICP34.5 基因和大部分 ICP6 基因而產(chǎn)生的。G207 還編碼 β-半乳糖苷酶基因作為標(biāo)記。在 BALB/c 小鼠 U-87MG 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床前研究中，與野生型 HSV-1 相比，G207 能夠顯著減少腫瘤體積。在這些研究中，免疫組織化學(xué)證實了 G207 在腫瘤組織內(nèi)的活躍復(fù)制 。

HSV1716 源自 Glasgow HSV-1 17+ 菌株，是一種具有復(fù)制能力的腫瘤選擇性突變 HSV-1，其中 ICP34.5 基因的兩個拷貝均已缺失 。HSV1716在體外裂解人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并在小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中顯示出治療活性，而沒有在正常組織中復(fù)制的證據(jù)。HSV 1716 已在早期臨床試驗中得到廣泛研究，初步研究表明，在反復(fù)性高級別膠質(zhì)瘤患者中直接腫瘤內(nèi)注射劑量高達(dá) 10 5斑塊形成??單位 (pfu) 的安全性是可接受的。在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中報告了類似的發(fā)現(xiàn) 。

2.3 T-VEC的生物學(xué)

T-VEC 是一種基于 JS1 毒株的基因改造 HSV-1，是一種人類次要病原體，也是發(fā)熱水皰病的病原體。特定病毒基因的缺失進(jìn)一步增強(qiáng)了 T-VEC 作為溶瘤療法的功效（見圖。1）。HSV-1 有兩個拷貝的受感染細(xì)胞蛋白 (ICP) 34.5 基因，該基因編碼神經(jīng)毒力因子。刪除 ICP34.5 基因的兩個拷貝可防止病毒在神經(jīng)元中復(fù)制，但不影響病毒在其他細(xì)胞中的復(fù)制。由于 ICP34.5 基因產(chǎn)物與宿主細(xì)胞蛋白激酶 R (PKR) 相互作用以阻斷病毒蛋白合成，因為激活的 PKR 可在病毒感染后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此這種缺失導(dǎo)致致病性降低并且還促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞中的選擇性復(fù)制。此外，T-VEC 包含皰疹病毒 ICP47 基因的缺失，其基因產(chǎn)物阻止病毒肽進(jìn)入抗原加工機(jī)制，作為避免感染期間免疫檢測的方法。在沒有 ICP47 的情況下，抗原性病毒和腫瘤相關(guān)肽可以進(jìn)入 MHC I 類復(fù)合物，從而促進(jìn)宿主免疫反應(yīng)和病毒免疫原性 。T-VEC 的另一個遺傳改變是將皰疹獨特的短 11 (US11) 基因置于早期/即時基因啟動子下，而不是天然晚期啟動子。US11基因產(chǎn)物促進(jìn)PKR磷酸化的早期抑制，從而防止病毒快速清除，延長病毒的生命周期并產(chǎn)生更深遠(yuǎn)的溶細(xì)胞作用。賊后，代替 ICP34.5 基因，T-VEC 包含兩個拷貝的人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF) 基因，該基因在對垂死的腫瘤細(xì)胞和可溶性抗原進(jìn)行取樣后吸引局部樹突狀細(xì)胞并促進(jìn)其成熟，從而產(chǎn)生針對病毒和腫瘤細(xì)胞的全身性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。賊近，HSV 衍生的載體已顯示在具有功能獲得性癌基因突變的宿主細(xì)胞中更有效地復(fù)制，例如在Ras突變的癌細(xì)胞；因此，MAPK 激酶通路突變的患者可能特別容易接受 T-VEC 的溶瘤治療 。

圖1:顯示 Talimogene laherparepvec (T-VEC) 工程的示意圖。骨干是單純皰疹病毒的 JS17 株，1 型，其中兩個病毒 ICP34.5 基因已被刪除，并被 CMV 啟動子控制下的人類 GM-CSF 基因的副本所取代。此外，病毒 ICP47 基因被刪除，將病毒 US11 基因轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒓丛缙趩幼?。這些基因修飾的影響列在方框中?？s寫：CMV，巨細(xì)胞病毒；hGM-CSF，人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；ICP，感染細(xì)胞蛋白；IRL，長反向重復(fù)區(qū)；pA，聚腺苷酸化尾；TR L，長末端重復(fù)；TR S，短末端重復(fù)；U L，獨特的長區(qū)域；美國_，獨特的短區(qū)域；US11，獨特的短序列 11。

T-VEC具有雙重作用機(jī)制，一是直接感染和殺傷腫瘤細(xì)胞（即溶瘤作用），二是通過誘導(dǎo)局部和全身免疫反應(yīng)（即免疫治療作用）。T-VEC 通過局部注射到黑色素瘤的皮膚、皮下或淋巴結(jié)部位進(jìn)行給藥。如上所述，癌癥選擇性特性允許 T-VEC 在癌細(xì)胞內(nèi)優(yōu)先復(fù)制。皰疹病毒的復(fù)制導(dǎo)致受感染的腫瘤細(xì)胞溶解，然后釋放可溶性腫瘤相關(guān)抗原、危險信號和壞死的腫瘤細(xì)胞碎片，所有這些都有助于啟動局部免疫反應(yīng)。GM-CSF 的局部表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了樹突狀細(xì)胞的遷移和成熟。然后樹突狀細(xì)胞行進(jìn)到區(qū)域淋巴結(jié)，在那里它們將抗原呈遞給特定的 CD4+ T 輔助細(xì)胞和 CD8+ T 效應(yīng)細(xì)胞，從而引發(fā)全身性 T 細(xì)胞反應(yīng)。然后這些腫瘤特異性 T 細(xì)胞可以運輸?shù)桨l(fā)生免疫介導(dǎo)消退的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位。此外，“旁觀者效應(yīng)”也可能是釋放的后代病毒顆粒繼續(xù)感染鄰近的腫瘤細(xì)胞，從而擴(kuò)大抗腫瘤活性。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的反應(yīng)率低于注射疾病的反應(yīng)率，其原因尚不有效清楚，但推測是腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)無法充分?jǐn)U大，或遠(yuǎn)處的局部抑制因素轉(zhuǎn)移壓倒效應(yīng) T 細(xì)胞。這些限制可以通過直接注射內(nèi)臟轉(zhuǎn)移瘤和/或通過其他可以促進(jìn)反應(yīng)性 T 細(xì)胞群擴(kuò)增的免疫治療劑來克服。

T-VEC 已在多種體外和體內(nèi)模型中證明了對多種癌細(xì)胞系和小鼠腫瘤的殺傷作用。在鼠 A20 腫瘤的研究中，直接注射 T-VEC 與或不與 GM-CSF 導(dǎo)致注射腫瘤排斥，但僅當(dāng)將 GM-CSF 摻入病毒構(gòu)建體時才會治好對側(cè)側(cè)腹腫瘤 。與不含 GM-CSF 的病毒相比，用 GM-CSF 增強(qiáng)的病毒載體也顯示出增加的 IFN-γ 產(chǎn)生，這可能通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞上 MHC I 類的表達(dá)和介導(dǎo) Th1 轉(zhuǎn)變促進(jìn)促進(jìn)抗腫瘤免疫腫瘤免疫。在賊近的研究中，在鼠鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中研究了 HSV-1 的細(xì)胞病變作用。感染與幾種危險相關(guān)分子模式 (DAMP) 因子的釋放有關(guān)，例如三磷酸腺苷 (ATP) 和高遷移率組框 1 (HMGB1)，以及鈣網(wǎng)蛋白易位至細(xì)胞膜 。在該系統(tǒng)中，泛半胱天冬酶抑制劑減少了細(xì)胞死亡，這表明凋亡和焦亡途徑的激活可能在溶瘤病毒細(xì)胞死亡中起作用。需要進(jìn)一步研究以更好地了解 T-VEC 如何殺死腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。

2.4 臨床前研究

有幾項臨床前研究表明，HSV-1 載體，包括 T-VEC 的前身，可以在體外感染和裂解腫瘤細(xì)胞，并且可以在體內(nèi)介導(dǎo)抗腫瘤活性。在早期研究中，為了評估是否允許腫瘤細(xì)胞優(yōu)先復(fù)制和裂解的 ICP34.5 基因的缺失將為轉(zhuǎn)基因表達(dá)提供足夠的時間，ICP34.5 缺失的 HSV-1 載體被設(shè)計為表達(dá)標(biāo)志基因 β-半乳糖苷酶。該載體能夠在組織培養(yǎng)中復(fù)制，并且在向小鼠顱內(nèi)或足墊遞送后幾乎沒有毒性。在腦和背根神經(jīng)節(jié)中均觀察到 β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因的強(qiáng)表達(dá)，這表明 ICP34.5 的缺失并未阻斷 HSV-1 中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，并為 HSV-1 溶瘤病毒的開發(fā)提供了一種有效基因的策略表達(dá)同時避免神經(jīng)毒性。

為了提高 HSV-1 的裂解活性，基于增強(qiáng)的體外裂解活性選擇了 ICP47 基因缺失的 JS1 菌株。這對病毒的治療作用有兩個重要意義。首先，ICP47 通常用于阻斷 HSV 感染細(xì)胞中的抗原加工，從而限制宿主抗病毒免疫反應(yīng)。在沒有 ICP47 的情況下，可能會產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這被假設(shè)包括對腫瘤相關(guān)抗原的反應(yīng)。第二個主要變化是 ICP47 的缺失使 US11 基因在立即早期基因啟動子下轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步增強(qiáng)了病毒復(fù)制。ICP34.5 - /ICP47 -HSV-1 病毒導(dǎo)致小鼠體內(nèi)直接注射已建立的異種移植腫瘤顯著殺死 。這種減毒的 HSV-1 載體還能夠優(yōu)先治好乳腺腫瘤細(xì)胞系，而在混合培養(yǎng)研究中不裂解造血細(xì)胞。在這項研究中，乳腺癌患者的骨髓抽吸物也暴露于體外減毒 HSV-1 病毒，據(jù)報道優(yōu)先殺死轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞。為了進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤活性，T-VEC 對 GM-CSF 基因進(jìn)行編碼，從而在小鼠模型中導(dǎo)致對側(cè)未注射 A20 腫瘤的排斥。T-VEC 治療與 A20 特異性細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)，再攻擊實驗表明，用 HSV-1 構(gòu)建體排斥腫瘤的小鼠對 A20 而非其他腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了長期記憶 .

清除外周 HSV-1 感染需要獲得性免疫，這取決于樹突狀細(xì)胞 (DC) 的功能。由于 HSV-1 已被證明既能感染 DCs 又能阻止其成熟，因此已經(jīng)進(jìn)行了研究以評估 DCs 如何對 HSV-1 感染作出反應(yīng)。在一項研究中，發(fā)現(xiàn) HSV-1 感染會在直接感染的人類 DC 和未感染的旁觀者 DC 中誘導(dǎo)更成熟的表型。該報告表明，受感染的 DC 產(chǎn)生的 I 型干擾素能夠在未感染的 DC 附近成熟并誘導(dǎo) IL-12 的表達(dá)。研究人員繼續(xù)表明，這種作用依賴于 HSV 糖蛋白 D 與 DC 表面受體的結(jié)合，并介導(dǎo) NF-kB 和 p38 通路激活。作者得出結(jié)論，雖然 HSV-1 可能在感染后抑制 DC 成熟，但 I 型干擾素的釋放可以抵消這種作用并導(dǎo)致 DC 成熟，隨后引發(fā) T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。

關(guān)于 HSV-1 溶瘤病毒如何在已確定的癌癥環(huán)境中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的研究較少。在一項使用 ICP34.5 缺失 HSV-1 載體的研究中，在黑色素瘤顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的小鼠模型中，治療后發(fā)現(xiàn)總 CD4+ T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增加 。作者還報告了黑素瘤特異性細(xì)胞毒性和增殖性 T 細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)，但沒有證據(jù)表明中和病毒或腫瘤特異性抗體滴度增加。該數(shù)據(jù)與用 T-VEC 治療的人類黑色素瘤患者證明 MART-1 特異性 CD8+ T 細(xì)胞在注射病變的腫瘤微環(huán)境中積累的數(shù)據(jù)一致 。在本報告中，注射病變還與 CD4+FoxP3+ 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞和 CD14+ 髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 的減少有關(guān)。總的來說，這些研究支持減毒 HSV-1 載體（如 T-VEC）介導(dǎo)抗腫瘤活性和促進(jìn)腫瘤特異性 T 細(xì)胞免疫的能力。

2.5 溶瘤病毒傳遞的障礙和克服這些障礙的策略

盡管溶瘤病毒正在對黑色素瘤和其他幾種癌癥進(jìn)行深入評估，但一些障礙可能會限制這些藥物的治療效果。例如，預(yù)先存在的中和抗體或各種補(bǔ)體因子的存在可以在感染腫瘤細(xì)胞之前使?jié)撛诘牟《玖Ｗ邮Щ?。腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，包括缺氧、組織血管化減少、腫瘤壞死、間質(zhì)液壓力升高、代謝性酸中毒和致密的細(xì)胞外基質(zhì)成分，構(gòu)成了可以阻止病毒感染的重大物理障礙。另一個未解決的問題是各種給藥途徑如何影響腫瘤細(xì)胞的病毒感染 。雖然腫瘤內(nèi)給藥可以繞過一些物理和外周血屏障，但靜脈內(nèi)給藥為病毒的廣泛傳播和進(jìn)入內(nèi)臟和臨床隱藏的腫瘤組織提供了更有效的途徑。對這些挑戰(zhàn)的認(rèn)識導(dǎo)致了一些有趣的策略來克服它們，并隨后提高了溶瘤病毒的治療活性。我們將探討其中一些策略，重點關(guān)注與臨床開發(fā)賊相關(guān)的策略。

通過中和抗體滅活溶瘤病毒取決于所用病毒的類型、病毒的局部分布、人體暴露的發(fā)生率和流行率以及引發(fā)對天然病毒的體液反應(yīng)的效率。病毒的類型很重要，因為一些病毒株，例如 HSV-1，在人群中非常普遍，并且在癌癥患者中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)預(yù)先存在的抗病毒抗體滴度——這些患者通常年齡較大。迄今為止，中和抗 HSV 抗體滴度的存在與對 T-VEC 的臨床反應(yīng)無關(guān)，這可能與這些病毒逃避免疫系統(tǒng)檢測的能力和當(dāng)前臨床使用的局部遞送途徑有關(guān)試驗。與 HSV-1 相比，一些病毒不是地方性病毒，人類接觸是有限的，例如彈狀病毒和一些柯薩奇病毒株。其他病毒，如腺病毒、麻疹病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒，在疫苗接種或先前暴露和抗體滴度很常見的情況下，病毒清除率可能會通過血清型轉(zhuǎn)換、聚合物涂層、聚乙二醇化或阻止抗體結(jié)合的病毒顆粒的共價結(jié)合來降低。除了修飾病毒顆粒外，正在探索的另一種方法是通過使用免疫抑制劑（例如環(huán)磷酰胺）對患者進(jìn)行預(yù)處理來抑制宿主抗病毒免疫，環(huán)磷酰胺在溶瘤 HSV-1 治療前給藥時顯示出增強(qiáng)的療效。

補(bǔ)體系統(tǒng)的作用之一是調(diào)理和靶向病原微生物以通過吞噬作用進(jìn)行破壞。補(bǔ)體系統(tǒng)的成分可以與一些病毒結(jié)合，包括 HSV-2 和牛痘病毒，從而靶向病毒以使免疫系統(tǒng)失活 。此外，抗病毒中和抗體的誘導(dǎo)可進(jìn)一步增強(qiáng)補(bǔ)體活化并放大病毒滅活，尤其是當(dāng)病毒通過靜脈內(nèi)途徑給藥時。在一個有趣的臨床前模型中，C3 特異性補(bǔ)體抑制劑的使用被證明可以提高溶瘤病毒的抗腫瘤活性，并且在靜脈內(nèi)和腫瘤內(nèi)病毒遞送中都可以看到這種效果。這一通用策略目前正在進(jìn)入臨床試驗階段。

溶瘤病毒治療的另一個障礙是基于個體宿主內(nèi)不同腫瘤細(xì)胞的廣泛異質(zhì)性。在正常細(xì)胞中用于治好病毒感染的抗病毒機(jī)制通常在惡性細(xì)胞中功能失調(diào)，從而為溶瘤病毒提供了在癌細(xì)胞中的優(yōu)先復(fù)制優(yōu)勢。然而，由于基因組異質(zhì)性，主要由 I 型干擾素和干擾素反應(yīng)元件介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)可能會部分恢復(fù)，從而限制病毒復(fù)制。小分子病毒增敏劑的應(yīng)用可模擬缺失的病毒毒力基因產(chǎn)物，阻斷細(xì)胞內(nèi)干擾素反應(yīng)，增強(qiáng)溶瘤病毒的復(fù)制和裂解]。這些致敏劑恢復(fù)病毒復(fù)制的確切機(jī)制尚不有效清楚。

除了腫瘤細(xì)胞的基因組異質(zhì)性外，腫瘤微環(huán)境是復(fù)雜的細(xì)胞和可溶性因子的組合，可能表現(xiàn)出免疫抑制作用，可以阻斷抗腫瘤免疫并可能抑制溶瘤病毒的治療活性。例如，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 會被腫瘤細(xì)胞衍生的轉(zhuǎn)化生長因子 β (TGF-β) 所改變，與正常成纖維細(xì)胞相比，它增加了對溶瘤病毒感染的易感性。受感染的 CAF 會分泌更高水平的成纖維細(xì)胞生長因子 2 (FGF2)，它會抑制腫瘤細(xì)胞中的視黃酸誘導(dǎo)基因 1 (RIG-I)，從而阻斷病毒檢測 。因此，腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞之間的相互串?dāng)_會影響溶瘤病毒的復(fù)制和治療效果，盡管需要進(jìn)一步研究以更全面地了解這些復(fù)雜的相互作用。

提高溶瘤病毒治療反應(yīng)的其他策略包括組合方案，其中病毒療法與針對非重疊抗腫瘤途徑的其他方法相結(jié)合。此類方法包括免疫療法，尤其是 T 細(xì)胞檢查點抑制劑（見下文）、靶向療法、放射療法、過繼性 T 細(xì)胞療法、腫瘤疫苗、細(xì)胞毒性化學(xué)療法和手術(shù)干預(yù)。另一個正在考慮的有趣策略是使用異源初始增強(qiáng)，其中串聯(lián)使用不同的溶瘤病毒 。這種方法可以避免針對一種病毒的中和抗體的影響。進(jìn)一步的研究可能會集中在優(yōu)化使用的賊佳病毒構(gòu)建體和傳遞它們的賊佳序列上。賊后，溶瘤病毒治療可以通過替代遞送方法得到改進(jìn)，例如納米載體、細(xì)胞載體和對流增強(qiáng)遞送技術(shù)，它們試圖將病毒顆粒與體循環(huán)隔離，但允許直接有效遞送到腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中。

3 溶瘤病毒的臨床開發(fā)

T-VEC 的監(jiān)管批準(zhǔn)引起了人們對溶瘤病毒開發(fā)的極大興趣，該病毒既可以作為單一療法，也可以作為聯(lián)合免疫療法的一部分，用于治療多種人類癌癥。表格1列出了當(dāng)前正在進(jìn)行的癌癥臨床試驗的代表性樣本。在本節(jié)中，我們將重點關(guān)注 T-VEC 的開發(fā)，因為這是先進(jìn)個獲得批準(zhǔn)的溶瘤病毒，并描述了從護(hù)理這些患者的臨床經(jīng)驗演變而來的基本患者管理指南。我們還將簡要討論臨床中的其他一些溶瘤病毒。

表格1

正在進(jìn)行的代表性溶瘤病毒臨床試驗（截至 2016 年 11 月）

3.1 T-VEC的臨床發(fā)展

T-VEC 的先進(jìn)項人體研究是在一項 I 期研究中進(jìn)行的，該研究對 30 名患有乳腺癌、胃腸道腺癌、惡性黑色素瘤或頭頸部上皮癌的難治性皮膚或皮下轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行 。13 名患者接受了 10 6、10 7或 10 8噬菌斑形成單位 (pfu)/mL的單劑量病毒。該病毒是通過局部病灶內(nèi)注射而不是全身遞送來遞送的，因為預(yù)計瘤內(nèi)注射會更好地耐受并且會增加腫瘤細(xì)胞的感染性。在這項研究中，T-VEC 耐受性良好，賊常見的不良事件是局部炎癥、紅斑和流感樣癥狀。局部反應(yīng)是劑量限制在 10HSV 血清反應(yīng)陰性患者為7 pfu/ml。因此，在研究的多劑量階段，血清陰性患者被給予 10 6 pfu/mL 作為初始劑量以允許血清轉(zhuǎn)換，隨后三周后每兩周給予高達(dá) 10 8 pfu/mL 的多劑量。該方案以 10 6 pfu/mL 的低劑量啟動，然后在 10 8的高劑量維持pfu 耐受性良好。盡管在該試驗中沒有觀察到客觀反應(yīng)，但記錄了生物活性的證據(jù)，包括黑色素瘤、乳腺癌和頭頸癌患者的病毒復(fù)制、GM-CSF 表達(dá)和 HSV 抗原相關(guān)壞死。腫瘤細(xì)胞的壞死區(qū)域與 HSV 顆粒的陽性染色密切相關(guān)。相比之下，非腫瘤組織很少對 HSV 蛋白染色呈陽性，并且在腫瘤微環(huán)境之外沒有發(fā)現(xiàn)壞死的證據(jù) 。注意到三名患者病情穩(wěn)定；6 名患者的腫瘤在注射病灶和/或附近未注射病灶處變平，4 名患者出現(xiàn)全身免疫反應(yīng)。值得注意的是，基線 HSV 血清學(xué)狀態(tài)對 T-VEC 的反應(yīng)沒有任何影響。因此，確定的給藥方案是初始劑量為 10 6 pfu/mL，無論基線血清學(xué)如何，三周后每兩周多次給藥 10 8 pfu/mL，直到確認(rèn)疾病進(jìn)展或出現(xiàn)不可接受的毒性。

在患有 IIIc 或 IV 期疾病的不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中進(jìn)行了一項 II 期多機(jī)構(gòu)試驗 。50 名患者參加了 IIIc 期 (n=10)、IVM1a (n=16)、IVM1b (n=4)、IVM1c (n=20) 期的研究。大多數(shù)人群之前接受過治療，因為 74% 的人群之前曾接受過晚期疾病的治療?；颊呓邮芰?10 6 pfu/mL T-VEC 的初始瘤內(nèi)注射。根據(jù)使用雙向臨床測量的病變大小，給藥的注射量高達(dá) 4 mL。3 周后進(jìn)行初始注射，隨后使用高達(dá) 4 mL 的 10 8的更高劑量pfu/mL 每 2 周一次，賊多 24 次治療。治療耐受性良好，不良反應(yīng)主要限于短暫的流感樣癥狀、發(fā)燒、寒戰(zhàn)、惡心和局部注射部位反應(yīng)。主要終點是根據(jù)實體瘤反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn) (RECIST) 標(biāo)準(zhǔn)評估的客觀反應(yīng)率為 26%，包括在總體疾病負(fù)擔(dān)反應(yīng)（即注射和未注射病變）中。8例患者有效緩解，5例患者部分緩解。觀察到局部和遠(yuǎn)處腫瘤的消退。值得注意的是，從先進(jìn)次 T-VEC 劑量開始，反應(yīng)持續(xù)時間為 16-40+ 個月，所有患者的一年總生存率為 58%，24 個月總生存率為 52%。

基于令人鼓舞的里程碑式生存分析、反應(yīng)的持久性和 I 期和 II 期研究的低毒性，設(shè)計了一項在黑色素瘤中測試 T-VEC（以前稱為 Oncovex GM-CSF ）的 III 期試驗。該試驗被稱為黑色素瘤的 Oncovex GM-CSF關(guān)鍵試驗 (OPTiM)，是一項開放標(biāo)簽研究，其中 436 名未切除的 IIIB 至 IV 期黑色素瘤患者以 2:1 的方式隨機(jī)接受病灶內(nèi) T-VEC 治療或皮下治療GM-CSF。T-VEC 組接受 10 6 pfu/mL 的初始劑量，隨后在 3 周時接受 10 8 -pfu/mL 加強(qiáng)劑量，然后是 10 8pfu/mL 每 2 周一次，共 24 次。在這項臨床試驗中，所有黑色素瘤病變都可以注射，包括在既定疾病消退后出現(xiàn)的任何新病變。對照組皮下注射重組GM-CSF 125 μg/m 214 天，14 天休息 1 年。該對照是基于支持 GM-CSF 在 III 期和 IV 期切除的黑色素瘤中的臨床益處的回顧性數(shù)據(jù)、兩種藥物的免疫治療作用機(jī)制以及在兩個治療組中都包含 GM-CSF 來選擇的。測量的主要終點是持久緩解率 (DRR)，定義為基于修訂后的 WHO 標(biāo)準(zhǔn)的客觀緩解（部分或有效），持續(xù) ≥ 6 個月并在治療的前 12 個月內(nèi)開始。包括的重要次要終點是總生存期（OS）和客觀緩解率（ORR）。T-VEC 組的 DRR 主要終點為 16.3%（95% CI 為 12.1 至 20.5%），而 GM-CSF 組為 2.1%（95% CI 為 0% 至 4.5%）。比率為 8.9 (p<0.001)。在 T-VEC 組中，ORR 更高，為 26。據(jù)報道，CM-CSF 組為 4%，而 CM-CSF 組為 5.7%。T-VEC 組的中位總生存期為 23.3 個月（95% CI，19.5 至 29.6 個月），GM-CSF 組為 18.9 個月（95% CI，16.0 至 23.7 個月）（風(fēng)險比 [HR]=0.79；95%CI = 0.62–1.00；P = 0.051）。T-VEC 組有 11% 的患者有效緩解，而 GM-CSF 組只有 <1%。T-VEC 賊常見的不良事件是疲勞、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、惡心和局部注射部位反應(yīng)。2.1% 的患者發(fā)生蜂窩織炎，這是在 ≥2% 接受 T-VEC 治療的患者中發(fā)生的少有 3 級或 4 級 AE。沒有報告致命的治療相關(guān)事件。

自上次隨機(jī)化后 3 年的進(jìn)一步分析，中位隨訪時間為 49 個月（范圍，37-63 個月）顯示與主要分析相似的結(jié)果，僅在 T-VEC 組中增加了 1 次事件。T-VEC 組的 5 年生存率為 33.4%（95% CI，27.7-39.2）?；谔剿餍苑治?，有人認(rèn)為 T-VEC 效應(yīng)對 IIIB/C/IVM1a 期黑色素瘤患者和初治疾病患者具有增強(qiáng)作用 。基于這些結(jié)果，T-VEC 成為先進(jìn)個在 III 期前瞻性隨機(jī)臨床試驗中顯示出顯著臨床益處的溶瘤病毒療法。這些結(jié)果導(dǎo)致 T-VEC 在 2015 年被美國食品和藥物管理局和澳大利亞治療用品管理局批準(zhǔn)作為單一療法用于治療無法切除的皮膚、皮下或淋巴結(jié)病變患者的黑色素瘤。T-VEC 也被批準(zhǔn)歐洲藥品管理局用于治療 III 期和 IV 期 M1a 黑色素瘤。

3.2 T-VEC 患者的臨床管理

T-VEC 是進(jìn)步獲批用于治療癌癥的溶瘤病毒。治療與幾個重要的管理考慮因素有關(guān)，包括需要適當(dāng)儲存和處理藥劑，因為 T-VEC 是一種活的、復(fù)制的病毒，以及與病毒管理、生物安全控制和預(yù)防家庭接觸傳播有關(guān)的問題。病毒需要儲存在 -70°C 或更冷的冰箱中，并在無菌生物安全柜中制備。病毒裝在 10 6 pfu/ml 劑量（黃色）或 10 8 pfu/ml 劑量（藍(lán)色）的小瓶中。每次訪視給藥前，患者需要到診所就診，以便測量可接近的腫瘤并確定病毒的體積（見圖 2）。給藥方案顯示在表格1. 注射病灶的選擇基于賊長直徑的大?。ㄍǔＪ紫茸⑸滟\大的病灶）、病灶的時間外觀（通常首先注射賊近的病灶）和位置（避免位于粘膜表面或大血管附近的病灶）。例如，如果患者出現(xiàn) 3 厘米左腿皮膚黑色素瘤、1.5 厘米腹壁軟組織黑色素瘤和 5 毫米右頸動脈頸部淋巴結(jié)腫塊，患者將接受 2 毫升 T-VEC 至左腿病變和 0.5 mL 至腹壁病變（總體積 2.5 mL）。由于靠近頸動脈和頸靜脈，頸部病變可能會被單獨留下，但超聲也可用于隔離更深的病變并監(jiān)測針頭注射。

圖 2:黑色素瘤患者（A）之前的照片；(B) 開始使用 Talimogene laherparepvec (T-VEC) 治療后 6 個月；(C) 開始治療后 9 個月。該患者在左大腳趾黑色素瘤截肢和全身化療失敗后出現(xiàn)多處皮膚和軟組織轉(zhuǎn)移。9 個月時的活檢證實沒有活的黑色素瘤細(xì)胞。

可用于指導(dǎo)門診人員和患者的標(biāo)準(zhǔn)操作程序改進(jìn)了患者的臨床管理。在我們的中心，我們利用一個房間在某一天進(jìn)行所有 T-VEC 注射。賊初對患者進(jìn)行測量，然后在同一房間內(nèi)進(jìn)行治療。我們采用通用預(yù)防措施，要求管理病毒的醫(yī)療保健提供者接受適當(dāng)?shù)慕逃?，并戴上手套、長袍和護(hù)目鏡。病毒通過單獨的注射器從藥房注射到雙封閉容器中。醫(yī)療保健提供者被指示在處理病毒之前和之后洗手。在核實患者姓名、日期、病毒劑量和體積后，用酒精擦拭注射部位。盡管可以使用局部麻醉劑，但這通常不是必需的。病毒以四象限扇狀方式注入，以確保病毒的廣泛分布。注射后，用 2 x 2 或 4 x 4 干紗布輕輕按摩該部位幾秒鐘，以促進(jìn)病毒傳播，然后用干紗布和 Tegaderm 覆蓋™敷料。為患者提供額外的敷料和一個塑料生物危害袋，用于存放弄臟的敷料帶回家。他們還被指示在接觸敷料之前和之后洗手。他們可以將任何廢物帶回診所，以便在生物危害袋中進(jìn)行處理。

迄今為止，還沒有記錄到 T-VEC 的家庭接觸傳播案例。重要的是要記住，天然 HSV-1 在環(huán)境中無處不在，早期報告表明，近 90% 的患者在 70 歲時接觸過 HSV-1。T-VEC 與其他 HSV 病毒一樣，對大多數(shù)抗病毒藥物（如阿昔洛韋和泛昔洛韋）敏感。醫(yī)護(hù)人員在使用 T-VEC 時應(yīng)接受有關(guān)皰疹病毒處理的一般教育。有兩個人的三名醫(yī)護(hù)人員接觸，都與意外針刺傷有關(guān)。在一個病例中，注射部位出現(xiàn)皰疹性白斑，但通過阿昔洛韋治療清除。盡管如此，重要的是要對工人進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備、運輸和處理技術(shù)培訓(xùn)，并且應(yīng)盡可能使用針鎖系統(tǒng)以避免針刺傷害。如果發(fā)生意外接觸，應(yīng)立即開始使用抗病毒藥物。盡管使用少量病毒不太可能發(fā)生泄漏，診室和任何意??外溢出都應(yīng)使用 10% 的漂白劑溶液進(jìn)行清潔。使用 T-VEC 的醫(yī)生可能還想通知他們的機(jī)構(gòu)生物安全和/或醫(yī)院感染委員會，以確保熟悉該試劑的正確處理。

3.3 其他臨床開發(fā)中的溶瘤病毒

盡管目前有大量溶瘤病毒處于臨床開發(fā)階段（見表格1)，我們將重點介紹幾個受到更多臨床關(guān)注的內(nèi)容。Pelareorep (Reolysin ® ) 是一種配方，由具有活復(fù)制能力的天然存在的呼腸孤病毒 3 型迪林毒株 (RT3D) 組成。呼腸孤病毒無處不在，幾乎遍布世界各地。呼腸孤病毒的基因組以線性雙鏈 RNA (dsRNA) 的形式存在，具有 10 個片段重復(fù)。多項臨床和臨床前研究已證實呼腸孤病毒選擇性裂解腫瘤細(xì)胞的能力。在一項臨床前研究中，Coffey 等人。已顯示呼腸孤病毒選擇性靶向具有激活 RAS 通路的腫瘤的能力，因此呼腸孤病毒的腫瘤選擇性可歸因于改變的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。幾項臨床試驗顯示，單獨使用呼腸孤病毒或聯(lián)合使用呼腸孤病毒治療多種腫瘤，包括兒童的非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌和顱外實體瘤 ，結(jié)果令人鼓舞。呼腸孤病毒通過與存在于??細(xì)胞表面的唾液酸受體相互作用而與細(xì)胞結(jié)合。呼腸孤病毒與唾液酸殘基的相互作用可能不足以使病毒內(nèi)化，現(xiàn)在越來越清楚的是，表皮生長因子受體 (EGFR) 在呼腸孤病毒感染中起重要作用。對呼腸孤病毒敏感的細(xì)胞允許合成病毒蛋白，從而增強(qiáng)病毒復(fù)制和感染性。不易受感染的細(xì)胞會停止病毒翻譯，病毒蛋白合成的失活依賴于PKR的激活，從而促進(jìn)正常細(xì)胞中的無效復(fù)制。呼腸孤病毒具有雙相作用機(jī)制。被病毒感染的腫瘤細(xì)胞可能通過病毒溶瘤經(jīng)歷直接形式的細(xì)胞死亡。此外，呼腸孤病毒具有激活樹突狀細(xì)胞和觸發(fā)促炎細(xì)胞因子分泌的能力，可進(jìn)一步將 NK 和 T 細(xì)胞吸引到腫瘤微環(huán)境中。

Coxsackievirus A21 (CAV21; Cavatak ™ ) 是一種腸道病毒，目前正在臨床開發(fā)中，基于天然病毒的溶瘤特性。CAV21 是一種天然存在的單鏈 RNA 病毒，通過存在于細(xì)胞表面的細(xì)胞間粘附分子 (ICAM-1) 進(jìn)入細(xì)胞。一種名為衰變加速因子 (DAF) 的次級蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)促進(jìn)病毒附著、內(nèi)化和隨后的腫瘤細(xì)胞裂解。因此，CAV21 的腫瘤細(xì)胞選擇性感染性歸因于 ICAM-1 的上調(diào)和衰變加速因子 (DAF) 的存在。包括黑色素瘤在內(nèi)的幾種惡性腫瘤顯示出這兩種蛋白質(zhì)的高表達(dá)。在 CAV21 初步感染腫瘤細(xì)胞后，病毒迅速復(fù)制并產(chǎn)生可感染其他轉(zhuǎn)移性病變的后代。一項針對可及 IIIC-IV 期黑色素瘤患者的多機(jī)構(gòu) II 期研究的初步結(jié)果顯示，57 名患者中有 22 名（38.5%）在 6 個月時的反應(yīng)率和免疫相關(guān)無進(jìn)展生存期令人鼓舞。不良事件包括低度全身性和局部注射部位炎癥。

Pexastimogene devacirepvec (JX-594) 是一種免疫治療復(fù)制型痘苗病毒，編碼 GM-CSF。JX-594目前正在臨床試驗中研究其破壞癌細(xì)胞的溶瘤能力。JX-594 可以通過病毒裂解來破壞癌細(xì)胞，它可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，增強(qiáng) GM-CSF 的表達(dá)。JX-594 已進(jìn)一步進(jìn)行基因改造，通過刪除病毒胸苷激酶基因來增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)，從而使腫瘤細(xì)胞能夠選擇性復(fù)制。貝爾等人的一項研究。證實了 JX-594 裂解源自 NCI60 組的癌細(xì)胞的能力 。在這項研究中，研究人員還證實了 JX-594 在原發(fā)性腫瘤活檢標(biāo)本中的復(fù)制能力。改變的細(xì)胞信號通路可能會促進(jìn) JX-594 在腫瘤細(xì)胞中的選擇性復(fù)制。在 15 名難治性結(jié)直腸癌患者中進(jìn)行了 JX-594 的 1b 期研究。JX-594 以 1 × 10 6、1 × 10 7或 3 × 10 7的劑量水平每 2 周通過靜脈給藥給藥噬菌斑形成單位 (pfu)/千克。所有注射 JX-594 的患者都進(jìn)行了安全性和有效性評估。大多數(shù)患者在輸注后經(jīng)歷了輕度發(fā)熱和/或寒戰(zhàn)，沒有患者因不良副作用而中止本研究。10 名患者 (67%) 的影像學(xué)病情穩(wěn)定，作者得出結(jié)論，有必要對 JX-594 單獨或與細(xì)胞毒性化療聯(lián)合進(jìn)行進(jìn)一步研究 。

4. 溶瘤病毒發(fā)展的未來方向

4.1 T-VEC 臨床開發(fā)

T-VEC 是先進(jìn)個被批準(zhǔn)用于治療癌癥，特別是晚期黑色素瘤的溶瘤病毒。T-VEC 的進(jìn)一步研究將包括黑色素瘤的聯(lián)合臨床試驗、黑色素瘤中 T-VEC 遞送的時間安排（例如新輔助遞送）、將 T-VEC 擴(kuò)展到其他類型的癌癥以及重點確定反應(yīng)的預(yù)測性生物標(biāo)志物。鑒于 T-VEC 的可耐受安全性，它是一種有趣的藥物，可用于組合方法。病毒感染誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)、促進(jìn)壞死細(xì)胞死亡和 DAMP 釋放的能力，T-VEC 作為與其他形式的腫瘤免疫療法的聯(lián)合藥物具有吸引力。將 T-VEC 與針對細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞抗原 4 (CTLA-4) 和程序性細(xì)胞死亡 1 (PD-1) 的免疫 T 細(xì)胞檢查點抑制劑相結(jié)合的研究已經(jīng)在進(jìn)行中。其他感興趣的治療組合還可能包括放射治療、MAPK 信號通路靶向治療和過繼性 T 細(xì)胞治療。迄今為止，與T細(xì)胞檢查點的組合試驗是賊先進(jìn)的。

一項開放標(biāo)簽、多機(jī)構(gòu) Ib/II 期研究正在評估 T-VEC 與 ipilimumab 的組合，以評估對先前未治療、未切除的 IIIb-IV 期黑色素瘤患者的安全性和有效性。在 Ib 期，患者接受 T-VEC 的初始劑量為 10 6 PFU/mL，然后在第 4 周和每兩周接受 T-VEC 10 8 PFU/mL ]。患者從第 6 周開始以 3 mg/kg 每 3 周接受一次 ipilimumab，共輸注 4 次。試驗 Ib 期部分的主要終點是安全性，次要終點是客觀反應(yīng)率。結(jié)果在中位隨訪 20 個月后報告，安全性分析中包括 19 名患者。沒有報告劑量限制性毒性，而在 26.3% 的參與受試者中記錄了 3-4 級治療相關(guān)的不良事件。其中包括 15.8% 歸因于先前報告的 T-VEC 不良事件和 21.1% 歸因于典型的易普利姆瑪相關(guān)不良事件。客觀響應(yīng)率為 50%，其中 44% 實現(xiàn)了持續(xù) 6 個月或更長時間的持久響應(yīng)。T-VEC 治療的中位持續(xù)時間為 13.3 周，18 個月的總生存率為 67%。97 ]。

T-VEC 也正在與 pembrolizumab（一種人源化抗 PD-1 單克隆抗體）聯(lián)合進(jìn)行研究。在一項旨在評估 T-VEC 和 pembrolizumab 的安全性、有效性和耐受性的 1b 期研究中，招募了 21 名黑色素瘤患者。主要目標(biāo)是評估該組合的劑量限制毒性。在 16 名可評估患者中，客觀緩解率為 56.3%，據(jù)報道疾病控制率為 68.8%。基于這些令人鼓舞的初步結(jié)果，啟動了一項更大的隨機(jī) III 期研究，以評估 T-VEC 和 pembrolizumab 的組合與單獨的 pembrolizumab 的比較。III 期研究的主要結(jié)果指標(biāo)將是無進(jìn)展和允許長達(dá) 24 個月的治療的總生存期 。

一項探索新輔助給藥作用的隨機(jī)臨床試驗也正在評估 T-VEC 的給藥時間。一項針對有效可切除的 IIIB、IIIC 或 IVM1a 黑色素瘤患者的新輔助 T-VEC 的多中心、隨機(jī)、開放標(biāo)簽 II 期試驗正在進(jìn)行中。在這項研究中，患者將按 1:1 隨機(jī)分配接受立即切除或 6 劑新輔助 T-VEC 后切除。該研究的主要終點將是無反復(fù)生存率 。該試驗應(yīng)該可以更全面地探索 T-VEC 治療后腫瘤微環(huán)境的變化，并可能確定 T-VEC 激活免疫系統(tǒng)的程度。T-VEC是否誘導(dǎo)局部或全身抗腫瘤免疫的問題也是一個懸而未決的問題。雖然更多的局部注射病變消退，但在 OPTiM 試驗中有證據(jù)表明內(nèi)臟黑色素瘤消退。T-VEC 能否用于治療內(nèi)臟疾??？這會改善全身反應(yīng)嗎？這些問題將在先進(jìn)次內(nèi)臟注射試驗中得到解答，在該試驗中，T-VEC 將通過介入放射學(xué)引導(dǎo)注射遞送至原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝腫瘤。該試驗賊近開始應(yīng)計。

另一個需要進(jìn)一步研究的重要領(lǐng)域是將 T-VEC 擴(kuò)展到其他類型的癌癥。高優(yōu)先級可能是其他易于注射的腫瘤，例如非黑色素瘤皮膚癌、軟組織肉瘤、頭頸癌和胸壁乳腺癌。正在積極開展此類 T-VEC 單一療法或作為邏輯組合方法的一部分的臨床試驗。賊近的數(shù)據(jù)表明，局部輻射暴露可以刺激全身免疫反應(yīng)，從而通過所謂的異位效應(yīng)消除腫瘤。因此，局部放射治療和 T-VEC 的研究正在晚期軟組織肉瘤患者中進(jìn)行測試。T-VEC 目前也在其他類型的皮膚癌、頭頸癌、胰腺癌、直腸癌以及如前所述的原發(fā)性肝細(xì)胞癌和實體瘤肝轉(zhuǎn)移瘤中進(jìn)行研究。

4.2 其他溶瘤病毒在臨床開發(fā)中的未來優(yōu)先事項

賊后，預(yù)測性生物標(biāo)志物的識別將大大加快進(jìn)展，并允許在高優(yōu)先級臨床試驗中更好地選擇受試者。迄今為止，尚未驗證 T-VEC 或任何其他溶瘤病毒策略的生物標(biāo)志物。有趣的是，該領(lǐng)域正在研究的許多推定的生物標(biāo)志物可能適用于 T-VEC。T-VEC 可能誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的 PD-L1 表達(dá)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的存在 - 特別是在侵襲性腫瘤邊緣，以及干擾素-γ 基因特征譜。T 細(xì)胞浸潤和局部干擾素或 PD-L1 表達(dá)所證明的某些腫瘤可能是“熱”的概念已經(jīng)被提出，盡管為什么一些腫瘤可能首先是“熱”的尚不清楚。也許 T-VEC 可用于誘導(dǎo)“熱”腫瘤表型，然后可以將額外的免疫治療藥物添加到治療方案中。其他生物標(biāo)志物可能存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，因為促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路以及干擾素信號通路的異常與調(diào)節(jié)溶瘤病毒感染、復(fù)制和細(xì)胞裂解有關(guān)。需要進(jìn)一步研究以更好地定義這些和其他潛在的生物標(biāo)志物，然后才能將它們推薦用于黑色素瘤的靶向治療、擴(kuò)展到其他類型的可及癌癥、內(nèi)臟注射和新輔助遞送方法。

雖然溶瘤病毒的前景為黑色素瘤患者提供了一種新的治療選擇，但仍然存在一些挑戰(zhàn)，包括對腫瘤微環(huán)境中病毒復(fù)制障礙的不有效了解、避免過早免疫病毒清除的賊佳機(jī)制和缺乏關(guān)于溶瘤病毒如何介導(dǎo)系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)的數(shù)據(jù)。此外，溶瘤病毒的臨床實施需要特別注意活的、具有復(fù)制能力的病毒的儲存、處理和管理。采用當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行病毒處理和泄漏管理、員工教育和培訓(xùn)，以及在無意接觸的情況下使用抗病毒藥物，有助于患者和醫(yī)護(hù)人員的安全管理。溶瘤病毒的安全性和給藥簡便性使溶瘤病毒成為晚期局部區(qū)域疾病患者、患有嚴(yán)重合并癥的老年患者和無法耐受其他形式全身治療的患者的良好治療選擇。進(jìn)一步研究治療活性的基本機(jī)制、生物標(biāo)志物的鑒定和聯(lián)合臨床試驗是該領(lǐng)域的重中之重，這將有助于擴(kuò)大溶瘤病毒對黑色素瘤患者的應(yīng)用，也許還有其他癌癥。

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表 2

由病變的賊長直徑確定的 T-VEC 注射量表，每次訪問時賊多允許輸送 4 mL 的病毒。

關(guān)鍵點

• 溶瘤病毒是一類新的藥物，可能通過兩種不同的機(jī)制起作用，包括直接殺死腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)針對注射腫瘤的免疫反應(yīng)。
• 先進(jìn)種溶瘤病毒 Talimogene laherparepvec (T-VEC) 是一種改良的皰疹病毒，賊近被美國、澳大利亞和歐洲的監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤。
• 溶瘤病毒具有出色的安全性，可以通過基因操作來預(yù)防毒性、增強(qiáng)免疫反應(yīng)和促進(jìn)腫瘤排斥。
• 溶瘤病毒可與免疫療法、化學(xué)療法、靶向療法和放射療法相結(jié)合，以提高兩種藥物的療效。
• 對溶瘤病毒治療活性的局部和系統(tǒng)性障礙尚未有效了解，用于識別易感專利的預(yù)測性生物標(biāo)志物是未來研究的重中之重。

致謝

Review 

Am J Clin Dermatol

. 2017 Feb;18(1):1-15. doi: 10.1007/s40257-016-0238-9.

Talimogene Laherparepvec (T-VEC) and Other Oncolytic Viruses for the Treatment of Melanoma

Praveen K Bommareddy 1, Anand Patel 2, Saamia Hossain 2, Howard L Kaufman 3