【佳學(xué)基因檢測(cè)】家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變（FEVR）基因檢測(cè)案例

致病基因鑒定基因碼詳細(xì)解剖該遺傳?。?/h2>

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜?。‵EVR）是一種高度異質(zhì)性和單基因遺傳性疾病，影響視網(wǎng)膜血管的發(fā)育。FEVR的臨床表現(xiàn)多樣，包括外周視網(wǎng)膜灌注不足、新生血管形成、玻璃體視網(wǎng)膜牽引、黃斑位移、視網(wǎng)膜褶皺和視網(wǎng)膜脫離（RD）。佳學(xué)基因分析收錄的病例發(fā)現(xiàn)，攜帶相同致病變異的家庭成員可能表現(xiàn)出不同的臨床特征，包括完全失明，或保持無癥狀。然而，該病并未顯示出性別差異。然而，由于該病的部分外顯性以及其與其他視網(wǎng)膜疾病（如高度近視或早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP））在眼底表現(xiàn)上的相似性，可能導(dǎo)致誤診或漏診。因此，結(jié)合眼底影像學(xué)檢查和基因篩查、致病基因鑒定基因解碼對(duì)于FEVR的診斷和遺傳咨詢至關(guān)重要。

FEVR具有多種遺傳方式，包括常染色體顯性遺傳（AD）、常染色體隱性遺傳（AR）和X連鎖遺傳。在患有家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜?。‵EVR）的人群中，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)致病基因。這些基因包括低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（LRP5）、frizzled-4（FZD4）、四跨膜蛋白12（TSPAN12）、鋅指蛋白408（ZNF408）、諾里病蛋白（NDP）、β-連環(huán)蛋白1（CTNNB1）、滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病3（EVR3）、驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員11（KIF11）、atonal同源基因7（ATOH7）、RCC1和BTB結(jié)構(gòu)域含蛋白1（RCBTB1）以及Jagged經(jīng)典Notch配體1（JAG1）。其中，F(xiàn)ZD4、LRP5、TSPAN12和NDP基因通過Norrin-β-連環(huán)蛋白（Wnt）信號(hào)通路在視網(wǎng)膜血管發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是約90%的患者的發(fā)病原因。值得注意的是，基于數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因檢測(cè)僅有50%的FEVR病例能夠識(shí)別出變異，剩余的50%可能與尚未發(fā)現(xiàn)的基因座或基因相關(guān)，數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)無法發(fā)現(xiàn)原因。通過基因解碼技術(shù)可以提高檢出率。因?yàn)椋瑱z測(cè)這些基因變異對(duì)于精確診斷和了解疾病的潛在發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

盡管已有多項(xiàng)研究通過二代測(cè)序技術(shù)和計(jì)算機(jī)分析證實(shí)了FEVR患者中變異的致病性，但在原子或分子水平上分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化的研究較少。分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬已在其他眼科研究中被應(yīng)用，用于研究突變蛋白對(duì)構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的影響，強(qiáng)調(diào)了這一方法在理解蛋白質(zhì)功能機(jī)制和疾病分子基礎(chǔ)中的重要性。

佳學(xué)基因檢測(cè)在動(dòng)態(tài)分子水平上探討FEVR變異的致病性，將靶向下一代測(cè)序（TGS）面板與MD模擬和分子對(duì)接相結(jié)合，明確了九個(gè)臨床診斷為FEVR的中國(guó)家庭中的新型致病變異。這一方法為理解FEVR的分子基礎(chǔ)提供更多證據(jù)，為更多的患者通過基因檢測(cè)明確病因提供了病例基礎(chǔ)。

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變病例

臨床數(shù)據(jù)來自于在佳學(xué)基因眼科合作醫(yī)院接受治療并確診為FEVR的患者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》并獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2020-KY-GZR019）。每位參與者或其法定監(jiān)護(hù)人在參與研究之前均簽署了知情同意書。  

所有患者及其家屬均接受了全面的眼科檢查，包括最佳矯正視力（BCVA）評(píng)估、裂隙燈生物顯微鏡檢查、眼底鏡檢查、超廣角眼底照相（UWFFP，Daytona P200T，OPTOS，F(xiàn)ife，英國(guó)）和眼底熒光素血管造影（FFA；Spectralis HRA + OCT，海德堡工程公司，海德堡，德國(guó)）。FEVR的診斷標(biāo)準(zhǔn)為患者表現(xiàn)出外周視網(wǎng)膜缺血、新生血管形成、刷狀血管、視網(wǎng)膜脫離（RD）、玻璃體出血、嚴(yán)重的視網(wǎng)膜下滲出物和黃斑偏位。根據(jù)Trese分期系統(tǒng)，為每只眼睛確定FEVR患者的疾病分期。此外，還收集了患者的基本信息，如性別、年齡、出生史和家族史。對(duì)于有早產(chǎn)史或其他視網(wǎng)膜血管疾病并具有類似臨床表現(xiàn)的患者，均排除在研究之外。
 

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變病例的分析解碼流程 

在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的致病基因解碼過程中，采集了患病者及其家庭成員的血樣進(jìn)行靶向下一代測(cè)序（TGS）。通過BaiMeng磁珠DNA提取試劑盒（BaiMeng，中國(guó)）從外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA。利用NadPrep全基因組文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（Swift Biosciences，美國(guó)）制備了全基因組文庫(kù)，并使用SureSelect XT HS2試劑盒（Agilent Technologies，美國(guó)）對(duì)511個(gè)目標(biāo)基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行選擇性富集。隨后，在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)（Illumina，美國(guó)）上進(jìn)行150-bp的雙端測(cè)序。使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件（麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究所，美國(guó)）將清洗后的讀段比對(duì)到人類參考基因組hg19（GRCh37）。去除PCR重復(fù)序列后，使用基因組分析工具包（GATK）軟件套件（Broad研究所，美國(guó)）進(jìn)行基質(zhì)量分?jǐn)?shù)重校正和變異調(diào)用。通過ANNOVAR軟件包（美國(guó)密歇根大學(xué)）對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行注釋，并使用多個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，包括dbSNP、ExAC、gnomAD和1000genomes。接下來，佳學(xué)基因排除了同義變異和不影響剪接信號(hào)的非編碼區(qū)變異。此外，具有較高小等位基因頻率（≥0.01）的變異也被排除。使用SIFT、MutationTaster、PolyPhen-2、REVEL和GERP +  + 等工具預(yù)測(cè)變異的致病性和蛋白質(zhì)功能。每個(gè)變異還在ClinVar和HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步篩查，以確認(rèn)是否為先前報(bào)道的變異。隨后，LRP5（參考NM_002335.4，mRNA）和TSPAN12（參考NM_012338，mRNA）基因中的突變進(jìn)行了驗(yàn)證，并作為候選變異選取用于進(jìn)一步分析。

使用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證在患病者及其家庭成員的DNA片段中識(shí)別出的疑似變異，確保外顯子測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證。采用Premier 5軟件（PREMIER Biosoft，美國(guó)）設(shè)計(jì)了特定引物，針對(duì)LRP5和TSPAN12中可能的變異位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。這些引物能夠擴(kuò)增包含致病變異位點(diǎn)的DNA片段。擴(kuò)增后，DNA片段被加入PCR混合液中，該液體包含DNA引物、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs，用于DNA合成）和適當(dāng)?shù)木彌_液。隨后的PCR過程經(jīng)過多個(gè)循環(huán)，包含DNA變性、引物退火和DNA延伸等步驟。PCR完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過QIAquick PCR純化試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）進(jìn)行純化，然后使用3730xl基因分析儀（Applied Biosystems，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序。來自家庭成員的序列與患病者的目標(biāo)DNA片段序列進(jìn)行精確比對(duì)。利用Chromas軟件（Technelysium Pty Ltd，澳大利亞），這些序列（包括患病者及其家庭成員的序列）與參考序列進(jìn)行比對(duì)，確保精確確定目標(biāo)區(qū)域的DNA序列。

最后，對(duì)每一個(gè)病例 進(jìn)行了家系共分離研究，并根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)（ACMG）指南評(píng)估潛在的致病性。

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變基因檢測(cè)病例的分析結(jié)果

在在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的致病基因解碼中，發(fā)現(xiàn)四個(gè)無關(guān)的FEVR家系中LRP5基因的3個(gè)變異和TSPAN12基因的1個(gè)變異符合ACMG標(biāo)準(zhǔn)，被判定為致病變異。兩種LRP5變異（c.4289delC（p.Pro1431Argfs*8）和c.2073G > T（p.Trp691Cys））是新發(fā)現(xiàn)的變異，通過分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬顯示這些變異對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了廣泛的改變。另兩種變異，LRP5基因中的c.1801G > A（p.Gly601Arg）和TSPAN12基因中的c.633 T > A（p.Tyr211*），則是以前報(bào)道過的。有基因檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大約50%的FEVR患者攜帶致病變異，其中LRP5基因的變異約占12%—25%，TSPAN12基因的變異約占3%—10%。不同種族中相同基因的突變頻率有所不同。在在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的致病基因解碼中，所有變異的總體檢測(cè)率為44%（4/9），這一結(jié)果與先前的報(bào)告一致。在所有FEVR患者中，75%（3/4）由LRP5變異引起，25%（1/4）由TSPAN12變異引起。然而，眼科基因檢測(cè)觀察到，在中國(guó)同一地區(qū)（寧夏），八個(gè)患病者中有四個(gè)（50%，4/8）攜帶TSPAN12（75%，3/4）和FZD4（25%，1/4）基因的致病變異，但其中沒有一個(gè)攜帶LRP5變異。將兩項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)結(jié)合起來顯示，在寧夏，LRP5基因占37.5%（3/8），而TSPAN12基因占50%（4/8）與FEVR相關(guān)。因此，LRP5和TSPAN12基因可能是寧夏人群中更為常見的致病基因。當(dāng)然，仍然需要通過更大樣本量的研究來驗(yàn)證這些結(jié)果，以排除選擇偏倚的可能性。由于缺乏文獻(xiàn)表明該病存在性別差異，我們?cè)诒狙芯恐形刺接懶詣e差異。

如前所述，LRP5基因的變異表現(xiàn)出常染色體顯性、隱性和X連鎖遺傳模式，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的紊亂。這些紊亂進(jìn)一步導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管發(fā)育異常，進(jìn)而引發(fā)與家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜?。‵EVR）相關(guān)的病變。此外，已有基因解碼基因檢測(cè)表明LRP5的隱性遺傳模式不僅會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管發(fā)育異常，還會(huì)引起嚴(yán)重的骨骼異常。在在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的致病基因解碼中，佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)了三種具有常染色體顯性遺傳模式的LRP5致病變異，其中新發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義變異c.2073G > T（p.Trp691Cys）位于高度保守的第三個(gè)YWTD-EGF-β-螺旋結(jié)構(gòu)域。LRP6的研究表明，第三個(gè)YWTD-EGF重復(fù)序列是與Wnt信號(hào)通路配體結(jié)合的區(qū)域。考慮到LRP5和LRP6蛋白的高度相似性，可以合理假設(shè)LRP5中的c.2073G > T（p.Trp691Cys）變異可能通過影響配體與YWTD-EGF-β-螺旋結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，進(jìn)而影響Wnt信號(hào)通路。另一種LRP5的框移突變c.4289delC（p.Pro1431Argfs*8）在在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的致病基因解碼中被發(fā)現(xiàn)，它導(dǎo)致蛋白質(zhì)在1437位置提前終止，產(chǎn)生一個(gè)截短的蛋白質(zhì)，可能由于功能喪失而具有致病性。

為了進(jìn)一步闡述動(dòng)態(tài)分子水平的致病機(jī)制，眼科致病基因鑒定基因解碼利用AlphaFold2對(duì)LRP5的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了建模，并實(shí)施了200納秒的MD模擬，分析了野生型和突變型蛋白質(zhì)的RMSD、RMSF、RG、HBNUM和DSSP值的變化。這些指標(biāo)表明，p.Trp691Cys和p.Pro1431Argfs*8變異可能通過改變LRP5蛋白的整體構(gòu)象，潛在地影響其配體結(jié)合，從而引發(fā)FEVR表現(xiàn)。大量研究和實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)特定區(qū)域的靈活性在打開配體結(jié)合位點(diǎn)中起著至關(guān)重要的作用，這種動(dòng)態(tài)行為與許多生物學(xué)功能密切相關(guān)，包括分子對(duì)接、催化活性和小分子運(yùn)輸。

在200納秒的p.Trp691Cys MD模擬中，佳學(xué)基因檢測(cè)觀察到Trp691被Cys691替代后，與相鄰殘基形成了新的氫鍵，這增加了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但減少了其靈活性。相反，p.Pro1431Argfs*8突變使蛋白質(zhì)在1437殘基處發(fā)生截?cái)啵瑢?dǎo)致次級(jí)結(jié)構(gòu)減少和氫鍵數(shù)量減少。此外，該變異還改變了特定殘基的極性，例如將帶正電荷的His1432改變?yōu)橹行訲hr，并將Glu1437替換為中性Ser。這些變化可能破壞了現(xiàn)有的鹽橋，增加了1261至1385殘基之間區(qū)域的動(dòng)態(tài)性，從而改變了其空間排列。

眼科疾病的發(fā)病原因的基因解碼的分子對(duì)接研究揭示了氫鍵相互作用對(duì)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合親和力的顯著影響。佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)四種突變蛋白（p.Trp691Cys、p.Pro1431Argfs*8、p.Trp691Ala和p.Pro1431Ala）與DKK1的結(jié)合自由能較低，親和力較高，尤其是p.Trp691Cys和p.Trp691Ala變異顯示了明顯降低的結(jié)合自由能，突出了Trp691殘基在蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)中的重要性。這些發(fā)現(xiàn)表明，這些突變可能增強(qiáng)與DKK1的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性，可能在調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。增強(qiáng)的結(jié)合可能導(dǎo)致DKK1對(duì)LRP5的抑制作用增強(qiáng)，可能通過促進(jìn)β-連環(huán)蛋白降解來抑制Wnt信號(hào)通路。

在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的致病基因解碼中，佳學(xué)基因檢測(cè)觀察到盡管攜帶相同的致病變異，患病者及其父母表現(xiàn)出不同的臨床表型。具體而言，患有嚴(yán)重FEVR的患者的父母通常表現(xiàn)出輕微的病癥，這與Gilmour的報(bào)告一致。此外，來自不同家系的攜帶相同變異的患病者，表現(xiàn)出不同程度的疾病嚴(yán)重性。例如，在在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的致病基因解碼中，攜帶TSPAN12變異（c.633 T > A: p.Tyr211*）的患病者4出現(xiàn)了視網(wǎng)膜脫離，而Zou等人報(bào)道相同的變異導(dǎo)致較輕的病癥，如玻璃體出血和外周缺血區(qū)或血管滲出。另有報(bào)道，較年輕的FEVR患者往往表現(xiàn)出較嚴(yán)重的表型。即使是攜帶相同致病變異的個(gè)體，也常因表觀遺傳學(xué)和環(huán)境因素的影響而表現(xiàn)出不同的表型。他們發(fā)現(xiàn)，氧氣含量或?qū)m內(nèi)條件（如PaO2變化或某些藥物的暴露）發(fā)生輕微變化時(shí)，可能會(huì)對(duì)攜帶FEVR致病變異的患者產(chǎn)生顯著影響。

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變基因檢測(cè)病例

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變的致病基因解碼成功識(shí)別了與FEVR相關(guān)的LRP5基因中的兩個(gè)新致病變異（c.2073G > T: p.Trp691Cys和c.4289delC: p.Pro1431Argfs*8），并結(jié)合突變篩查和分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行分析。這擴(kuò)展了眼科基因檢測(cè)對(duì)FEVR相關(guān)突變的理解，并為FEVR患者的遺傳研究開辟了新的方向。佳學(xué)基因強(qiáng)烈倡導(dǎo)開展家庭咨詢和遺傳教育項(xiàng)目，為受影響個(gè)體和家庭提供有關(guān)疾病遺傳學(xué)方面的綜合見解。還建議定期進(jìn)行眼科篩查，以便早期診斷和個(gè)性化治療。強(qiáng)調(diào)跨學(xué)科合作可以促進(jìn)知識(shí)交流和全面的患者護(hù)理，旨在實(shí)現(xiàn)早期診斷、改善個(gè)性化治療，并最終降低FEVR的發(fā)病率。