【佳學基因檢測】魚鱗病基因檢測結(jié)果的多病例分析與掌跖角化病鑒別診斷

佳學基因檢測為什么把魚鱗病做為重點檢測病種

根據(jù)《皮膚質(zhì)量的基因檢測與分析》，遺傳性魚鱗病包括一系列異質(zhì)性皮膚病；它主要表現(xiàn)為皮膚廣泛角化過度、干燥和脫屑。有時，重疊癥狀需要在魚鱗病和其他幾種類似疾病之間進行鑒別診斷。本致病基因鑒定基因解碼報告了七名通過進行徹底的臨床和遺傳調(diào)查確診或懷疑與魚鱗病有關(guān)的患者。使用全外顯子組測序進行基因檢測，以桑格測序作為驗證方法。使用 MEGA7 程序分析受檢測到的錯義變異影響的氨基酸殘基的保守性。入選患者表現(xiàn)出類似魚鱗病但不同的臨床表現(xiàn)。基因分析確定了 FLG 、STS、KRT10和SERPINB7基因中的診斷變異，并闡明了各自家族成員中每種變異的攜帶情況。受檢測到的錯義變異影響的兩個殘基在多個物種中保持保守性。值得注意的是， STS : c.452C>T(p.P151L) 和 c.647_650del(p.L216fs)兩個變異是數(shù)據(jù)庫中沒有收錄的，因此基于數(shù)據(jù)庫比對的基因檢測對這兩例病例的檢測結(jié)果總是呈現(xiàn)出陰性結(jié)果。總之，本致病基因鑒定基因解碼為入組魚鱗病相關(guān)患者做出了明確的遺傳鑒別診斷；致病基因鑒定基因解碼結(jié)果也擴大了魚鱗病的突變譜，并為受影響家庭的咨詢提供了有力的證據(jù)。

魚鱗病基因檢測結(jié)果的多病例分析與掌跖角化病鑒別診斷關(guān)鍵詞：

遺傳性魚鱗病、FLG、STS、KRT10、SERPINB7

詳細了解魚鱗病基因檢測的科學性與必要性

魚鱗病是一大類異質(zhì)性角化疾病的總稱，這些疾病通常是單基因的，主要特征是皮膚大面積角化過度、干燥和脫屑；有時，魚鱗病還伴有綜合征特征。數(shù)百種基因編碼相應的蛋白質(zhì)，在角質(zhì)形成細胞的正常分化中發(fā)揮作用，并參與功能性表皮屏障的形成。因此，遺傳性魚鱗病和相關(guān)的角化疾病可能具有復雜的病因和重疊的表現(xiàn)；這對臨床診斷和基于數(shù)據(jù)庫的基因檢測提出了巨大的挑戰(zhàn)。

總體而言，《人體基因序列與疾病表征》詳細介紹了四種主要類型的非綜合征性魚鱗病，即尋常型魚鱗病 (I. vulgaris 或 IV)、X 連鎖魚鱗病、常染色體隱性先天性魚鱗病 (ARCI) 和角化病性魚鱗病。迄今為止，已鑒定出至少 67 個與各種形式的遺傳性魚鱗?。ňC合征型或非綜合征型）相關(guān)的基因；這些基因包括絲聚蛋白基因 [ FLG；人類在線孟德爾遺傳 (OMIM) 編號。 135940]、類固醇硫酸酯酶（STS；OMIM 編號 300747）、角蛋白基因（KRT1 / KRT10；OMIM 編號 139350/148080）和 ATP 結(jié)合盒亞家族 A 成員 12（OMIM 編號 607800）。隨著基于下一代測序 (NGS) 的基因診斷方法的進展，目前約 80–90% 的遺傳性魚鱗病病例可得到明確的基因檢測結(jié)果；這不僅有利于發(fā)現(xiàn)遺傳原因和新的突變，也有利于佳學基因等機構(gòu)在一手資料的基礎上建立基因型-表型關(guān)聯(lián)。

IV (OMIM 編號 146700) 是最常見的魚鱗病類型（患病率 ~1/300），典型特征是細小的淺灰色鱗屑，是由常染色體、半顯性、遺傳的 FLG 基因功能喪失突變引起的。雙等位基因FLG突變患者約占所有病例的 2/3，其癥狀往往比單個雜合突變患者更嚴重。迄今為止，已檢測到 175 多種可導致 IV、皮膚干燥癥或特應性皮炎的FLG變異（ https://www.hgmd.cf.ac.uk/；pro V2023.2）。第二種最常見的類型是 X 連鎖魚鱗病 (XLI)，在男性中的患病率約為 1/2,000，是由 STS 缺乏引起的；這種疾病常常與其他臨床問題有關(guān)，例如隱睪或社交溝通缺陷，如注意力缺陷或多動綜合癥和自閉癥，這反映了STS基因的多效性。另一組常見的魚鱗病是 ARCI，患病率約為 1/100,000；這種疾病與至少 10 個參與?；窠?jīng)酰胺、脂質(zhì)板層和角化脂質(zhì)包膜生物合成的基因有關(guān)。幾種其他罕見形式的魚鱗病經(jīng)常出現(xiàn)在皮膚病臨床環(huán)境中，這越來越依賴基因診斷進行鑒定。

致病基因鑒定基因解碼魚鱗病基因檢測項目組在一個分析中，重點分析了7位患有魚鱗病或類似疾病的患者，通過全外顯子組測序（WES）進行基因分析。檢測到的變異分布在多個基因中，反映了該疾病的異質(zhì)性和復雜性。這些變異豐富了魚鱗病的突變譜，為受影響家庭的遺傳咨詢提供了有力的證據(jù)。

佳學基因魚鱗病基因檢測與基因解碼分析的主要組成

患者的分析入組

本次魚鱗病基因檢測的檢測過程中，遵循醫(yī)學分析與臨床檢驗的國際通過標準，所有參與者均已知情同意進行基因檢測并將結(jié)果用于致病基因鑒定基因解碼。此外，還獲得了患者父母/法定監(jiān)護人的書面知情同意，同意公布其病歷詳情和任何隨附圖像。本致病基因鑒定基因解碼中執(zhí)行的所有程序均符合《赫爾辛基宣言》（1964 年）及其后來的修正案或類似的道德標準。

檢測樣本收集于2019 年 1 月至 2022 年 12 月期間，收集了患有皮膚角化過度、皮膚干燥和脫屑的患者，特別是有這些癥狀家族史的患者。醫(yī)生根據(jù)常規(guī)臨床檢查和家庭調(diào)查對患者進行臨床評估。佳學基因檢測使用 QIAamp DNA Midi Kit（Qiagen GmbH）及其等效試劑從患者及其父母的外周血樣本中提取基因組 DNA 以進行進一步分析。

進行全外顯子測序以滿足致病基因鑒定基因解碼的要求

使用 WES 檢測先證者樣本中的序列變異，如佳學基因致病基因鑒定項目組小組先前致病基因鑒定基因解碼中所述。簡而言之，使用 Agilent Sure Select 人外顯子序列捕獲試劑盒（安捷倫科技公司）進行目標區(qū)域序列富集。通過定量 PCR 測試 DNA 文庫，其中使用 Agilent Bioanalyzer 2100（安捷倫科技公司）確定大小、分布和濃度。通過利用~150 bp 雙端讀取，使用 NovaSeq6000 平臺（Illumina 公司）對每個樣本進行 DNA 測序，使用 NovaSeq 試劑盒（Illumina 公司）。使用 Burrows Wheeler Aligner 工具 ( https://www.geneticsmr.com/keywords/burrow-wheeler-aligner-tool )將測序原始讀段 (質(zhì)量水平 Q30>90%)  與人類參考基因組 (登錄號 hg19/GRCh37 ) 比對。使用 Picardv1.57 ( https://github.com/broadinstitute/picard )刪除 PCR 重復序列。使用 Verita Trekker® 變異檢測系統(tǒng) (v2.0; Berry Genomics) 和基因組分析工具包 ( https://software.broadinstitute.org/gatk/ ) 進行變異調(diào)用。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學會 (ACMG) 發(fā)布的通用指南 ，使用 ANNOVAR (v2.0) 和 Enliven® 變異注釋解釋系統(tǒng) (Berry Genomics) 對變異進行注釋和解釋。為了準確解釋變異的致病性，佳學基因致病基因鑒定項目組參考了三個頻率數(shù)據(jù)庫（ExAC_EAS；http://exac.broadinstitute.org；gnomAD_exome_EAS，http://gnomad.broadinstitute.org；和 1000G_2015aug_eas，http ://www.internationalgenome.org ）和人類基因突變數(shù)據(jù)庫 (HGMD) pro V2021.10（https://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）。同時還采用了Revel 評分（一種致病性預測的組合方法，損傷閾值為 ≥0.700）和 pLI 評分（代表對截短變異的容忍度）。使用 3730 DX 基因分析儀（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）對疑似變異進行Sanger 測序作為驗證方法。

錯義變體的保守性和結(jié)構(gòu)分析

使用在線工具 MEGA7（http://www.megasoftware.net/.php）和默認參數(shù)分析了相應錯義變體對所有受影響氨基酸殘基的進化保守性。此外，使用 SWISS-MODEL 在線程序（https://swissmodel.expasy.org/）和默認參數(shù)生成模型，并將野生型 (WT) 和突變型 (MT) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與錯義變體進行比較。

魚鱗病查基因、阻遺傳不同分析過程的結(jié)果

臨床表現(xiàn)

2019 年 1 月至 2022 年 12 月期間，佳學基因合作醫(yī)院共招募了 7 例疑似魚鱗病患者。7 例患者均表現(xiàn)出疑似與魚鱗病相關(guān)的皮膚學表型，但存在一定的差異，且每例患者都有自己的特點（表 1）。病例 1 為 15 歲女性患者，患有尋常型魚鱗病。病例 2 為 4 歲男性患者，其父親和祖父也患有魚鱗病。病例 3 為 17 歲女性患者，主要臨床表現(xiàn)為魚鱗病和特應性皮炎。病例 4 為 2 個月大男性，以魚鱗病和隱睪為主要臨床癥狀。病例 5 為 18 歲女性，主要臨床癥狀為魚鱗病和注意力缺陷；該患者的父親也有魚鱗病。病例6為1月齡男性，主要臨床癥狀為角化過度、皮膚鱗屑。病例7為16歲女性，主要臨床癥狀為掌跖角化過度、棘皮癥。

表1.本致病基因鑒定基因解碼中七個病例的臨床指征和基因變異。

注：

• a：三個數(shù)據(jù)庫中的頻率。
• b：Revel評分。Revel 是一種基于單個工具預測錯義變異致病性的集成方法：MutPred、FATHMM、VEST、PolyPhen、SIFT、PROVEAN、MutationAssessor、MutationTaster、LRT、GERP、SiPhy、phyloP 和 phast Cons（http://dx.doi.org/10.1016/j.ajhg.2016.08.016）。ACMG，美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院；HGMD，人類基因突變數(shù)據(jù)庫（專業(yè)版 2021.10）；DM，致病突變；P，致??；LP，可能致病；PVS1，變異標準“致病性非常強”；PS1-4，變異標準“致病性強”；PM1-6，變異標準“致病性中等”； PP1-5，變異標準“致病支持”；M，男性；F，女性；STS，類固醇硫酸酯酶；FLG，絲聚蛋白；KRT，角蛋白；ABCA，ATP 結(jié)合盒亞家族 A。

基因檢測結(jié)果及遺傳分析圖譜

表1總結(jié)了每個基因變異的詳細信息，包括在三個人群數(shù)據(jù)庫中的頻率、在HGMD數(shù)據(jù)庫中的指數(shù)狀態(tài)、Revel評分和根據(jù)ACMG標準的致病性水平。圖1顯示了NGS或Sanger測序驗證的結(jié)果，以及每個家系的譜系圖和變異攜帶情況。

在這 7 名患者中，診斷性變異是在魚鱗病相關(guān)致病基因中發(fā)現(xiàn)的。病例 1-3 與 IV 有關(guān)，因為先前致病基因鑒定基因解碼報告了已知的FLG變異；病例 1（圖 1A 和 B）和病例 3（圖 1E 和 F）是新發(fā)病，病例 2 是家族性病因（圖 1C 和 D ）。病例 4 和 5 因STS變異而屬于 XLI ；病例 4 有一個先前報道的整個STS基因缺失的變異，遺傳自其雜合攜帶者母親（圖 1G 和 H），而病例 5 攜帶一個新的變異，即STS :c.452C>T(p.P151L)，遺傳自其有癥狀的父親（圖 1I 和 J）。病例 6 具有新生的已知雜合KRT10 : c.449T>C(p.M150T) 變異，被確定患有表皮松解性角化過度癥（OMIM 編號 113800；圖 1K 和 L ）。病例 7 具有SERPINB7的復合雜合變異，包括 c.796C>T(p.R266*) 和 c.647_650del(p.L216fs)；因此，該患者被確定患有長島型掌跖角化病（OMIM 編號 615598）。這兩個變異是從其父母那里遺傳的（圖 1M-O）。

突變的基因是如何導致患者發(fā)生疾病的？結(jié)構(gòu)與功能的基因解碼分析

這些變異中，有兩個錯義變異，分別為STS :c.452C>T(p.P151L)和KRT10 :c.449T>C(p.M150T)，對它們各自影響的氨基酸殘基進行保守性分析，表明這些殘基在物種間具有高度保守性(圖2A和B )。使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (PDB；( https://www.rcsb.org/structure/1P49 for STS:p.P151L ) 和 alpha fold (AF; AF- P13645 -F1; https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/P13645 for KRT10:p.M150T ) 對這兩個錯義變體進行預測和結(jié)構(gòu)分析。值得注意的是，結(jié)果表明，兩種突變體均未顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而僅改變局部氫鍵的長度，這可能影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 (圖 2C 和 D )。

魚鱗病基因檢測對患者和社會的幫助

遺傳性魚鱗病和角化病是一組表型異質(zhì)性的疾病，與表皮結(jié)構(gòu)成分、表皮脂質(zhì)代謝、細胞間粘附或角質(zhì)形成細胞分化等多種基因有關(guān)。此類疾病患者一般表現(xiàn)為皮膚干燥、鱗狀，表型變異較大。傳統(tǒng)診斷方法中，電子顯微鏡和組織免疫熒光可鑒別特異性類型，但這些方法成本高、侵入性強、繁瑣，應用受限。NGS 憑借高通量、高效、準確的優(yōu)勢，正逐漸成為診斷遺傳性皮膚病的一線技術(shù)。

含有STS基因的 Xp22.31 微缺失解釋了 XLI 發(fā)病的 80% 以上。在本致病基因鑒定基因解碼的病例 5 中，先證者攜帶父系遺傳的雜合STS錯義變異，且先證者的父親也表現(xiàn)出典型的魚鱗病癥狀。這種情況很少見，因為 XLI 通常被認為是 X 連鎖隱性遺傳病，而攜帶 Xp22.31 重復的女性攜帶者往往表現(xiàn)為水皰/脫屑等皮膚癥狀。因此，進一步致病基因鑒定基因解碼該錯義變異如何影響 STS 功能以及在病例 5 中的女性攜帶者中引起指征是很有意義的。保守性分析的結(jié)果支持該變異的致病性。

角蛋白病性魚鱗病 (KI) 是由角蛋白基因KRT1、KRT10和KRT2突變引起的，其中KRT10突變占 50% 以上 。本致病基因鑒定基因解碼中病例 6 攜帶的新生錯義變異最早由 Paller等于 1994 年發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)與 KI 的嚴重亞型表皮松解性角化過度癥有關(guān)；這一發(fā)現(xiàn)表明，該變異可作為 KI 患者的篩選目標。該變異影響的氨基酸在物種間保持高度保守，進一步支持其致病性。該病例和病例 5 中的錯義變異的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果并非毫無疑問的強支持；然而，需要更詳細的分析，如分子動力學模擬和體外功能實驗，以闡明具體變異的機制。

病例 7 最初是一個令人困惑的病例，最終通過基因診斷確定其與典型的魚鱗病無關(guān)?；颊呋加虚L島型掌跖角化病 (NPPK；OMIM 編號 615598)。NPPK 最初被認為是由SERPINB7中的雙等位基因假定功能喪失突變 (OMIM 編號 603357) 引起的，而 c.796C> T (p.R266*) 突變被認為是東亞人群的主要創(chuàng)始突變。迄今為止，多項致病基因鑒定基因解碼已確定了 20 多種致病變異[STS: c.452C>T(p.P151L) ( https://www.hgmd.cf.ac.uk/)(32-36 ) ] 。佳學基因致病基因鑒定項目組對病例 7 的發(fā)現(xiàn)不僅證實了此 c.796C>T 變異的廣泛流行，而且還貢獻了一個新變異 c.647_650del(p.L216fs)，從而擴大了SERPINB7基因的突變譜。值得注意的是，該病例的其他兄弟姐妹患此病的可能性為 25%；因此建議進行適當?shù)幕驒z測。

本致病基因鑒定基因解碼招募了患有皮膚角化過度、干燥癥和脫屑的患者。佳學基因致病基因鑒定項目組中心共招募了 7 名疑似魚鱗病患者。根據(jù)基因發(fā)現(xiàn)，為其家屬提供了適當?shù)淖稍?，并建議患者親屬也應接受針對性檢測。對于有家族遺傳模式的家庭，例如病例 2、4、5 和 7，建議他們考慮對后續(xù)妊娠進行產(chǎn)前診斷，以確定妊娠過程或計劃對新生兒進行充分的照顧。對于有新生模式的家庭（病例 1、3 和 6），提醒他們由于存在性腺嵌合體的可能性，未來復發(fā)的風險并非極低。由于不同的變異導致這 7 名患者的表型不同，因此魚鱗病的基因型-表型相關(guān)性需要使用更多的遺傳數(shù)據(jù)進一步闡明。

綜上所述，本致病基因鑒定基因解碼對7例魚鱗病合并NPPK患者進行了全面的臨床和遺傳學分析，并檢測了各自的診斷性突變。WES在這7例患者中檢測到了FLG、STS和KRT10基因的診斷性變異。共檢測并確認了8個變異。在所有變異中，有兩個是首次發(fā)現(xiàn)的，即STS ：c.452C>T(p.P151L)和c.647_650del(p.L216fs)。本致病基因鑒定基因解碼結(jié)果進一步豐富了魚鱗病的突變譜，并在1例NPPK患者中發(fā)現(xiàn)了SERPINB7基因的新變異，這一發(fā)現(xiàn)為進一步致病基因鑒定基因解碼其發(fā)病機制提供了基礎。