【佳學(xué)基因檢測】肝癌靶向藥物基檢測中基因突變與靶向藥物的匹配

肝癌靶向藥物基因檢測如何保證肝腫瘤患者的多樣性

為了評估LIMORE模型對原發(fā)性肝癌基因組和轉(zhuǎn)錄組的代表性程度，肝癌靶向藥物基因解碼利用全基因組測序（WGS）在81個(gè)模型中鑒定了拷貝數(shù)改變（CNAs）、體細(xì)胞突變和HBV整合。通過RNA測序還確定了表達(dá)譜。靶向藥物基因檢測收集了來自癌癥基因組圖譜（TCGA）（Cancer Genome Atlas Research Network. Electronic address and Cancer Genome Atlas Research, 2017）和其他已發(fā)表的隊(duì)列中的基因檢測數(shù)據(jù)，以代表原發(fā)性人類肝癌。

通過WGS在LIMORE模型中鑒定了原發(fā)性肝癌的典型CNAs，包括染色體級別的獲得（1q、8q）和缺失（4q、17p），CDKN2A和AXIN1的純合性缺失以及包含F(xiàn)GF19和CCND1的局部擴(kuò)增。LIMORE模型的整體拷貝數(shù)譜與原發(fā)性肝癌非常相似。佳學(xué)基因進(jìn)一步比較了細(xì)胞模型和不同類型人類癌癥的原發(fā)癌之間的CNA譜和外顯子體細(xì)胞突變。值得注意的是，LIMORE模型與肝癌之間的相關(guān)性最高。體細(xì)胞突變的聚類分析還顯示，LIMORE模型與80%的原發(fā)性肝癌緊密聚集。在66個(gè)HBV陽性模型中，檢測到了60個(gè)模型中的353個(gè)HBV整合斷點(diǎn)。最常見的HBV整合位點(diǎn)TERT在LIMORE模型中出現(xiàn)的頻率為28.6%（16/60），與原發(fā)性肝癌的頻率相當(dāng)。這些數(shù)據(jù)表明，肝部腫瘤靶向藥物基因檢測所采用的LIMORE模型反映了原發(fā)性肝癌的基因組變異。

在建立了肝癌靶向藥物基因檢測基因變異信息多樣性的模型之后，腫瘤正確用藥基因解碼比較了LIMORE模型和原發(fā)癌之間的轉(zhuǎn)錄組。主成分分析顯示，LIMORE模型與TCGA肝癌聚集在一起。此外，90%的TCGA肝癌的表達(dá)譜與至少一個(gè)LIMORE模型呈正相關(guān)（皮爾遜相關(guān)系數(shù)r > 0.7），表明LIMORE保留了部分原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)錄組特征。佳學(xué)基因進(jìn)一步確定LIMORE是否保留了與轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的功能異質(zhì)性。根據(jù)基因解碼，原發(fā)性肝癌可分為與浸潤能力相關(guān)的三個(gè)亞類。LIMORE模型被分類為Hoshida的S1（40%）、S2（30%）和S3（30%）亞類，S1亞類的百分比稍高（原發(fā)性HCC中為28%-32%），S3亞類的百分比較低（原發(fā)性HCC中為45%-57%）。LIMORE模型的亞類與遷移能力良好相關(guān)，表明LIMORE模型保留了原發(fā)性肝癌的一些功能異質(zhì)性。

肝腫瘤的靶向藥物基因檢測如何真實(shí)反映患者的基因突變

在進(jìn)行肝癌患者的基因突變大數(shù)據(jù)分析中，佳學(xué)基因?qū)Ρ攘薒IMORE是否捕獲了原發(fā)性肝癌中的主要致癌變異。腫瘤正確治療基因解碼從6個(gè)已發(fā)表的隊(duì)列中匯編了癌癥基因。佳學(xué)基因共確定了70個(gè)具有重復(fù)突變和2個(gè)具有拷貝數(shù)改變的基因作為肝癌的癌癥功能基因（CFGs）。與其他27種癌癥類型相比，有29個(gè)CFGs是肝癌所特有的，包括ALB、RPS6KA3和HNF4A。這些獨(dú)特的變異突出了肝癌特異性模型的必要性。

LIMORE模型捕獲了原發(fā)性肝癌中的CFG變異，包括TP53、TERT和FGF19等高頻變異，以及HNF4A和NFE2L2的低頻變異。LIMORE模型中CFG變異的整體譜與原發(fā)性肝癌相當(dāng)（Spearman r = 0.70，p = 7.2e-12）。有10個(gè)CFGs，包括TP53和CTNNB1，在LIMORE和原發(fā)性肝癌中顯示出不同的突變率?？偣?1個(gè)CFGs（85%）至少被1個(gè)模型覆蓋，而37個(gè)CFGs（51%）至少被3個(gè)模型覆蓋。相比之下，以前的模型中只有10個(gè)CFGs（14%）被至少3個(gè)肝癌模型覆蓋。LIMORE提高了常見CFGs的覆蓋范圍，例如TERT HBV整合（16個(gè)模型對比3個(gè)模型）和CTNNB1激活突變（8個(gè)模型對比3個(gè)模型），并捕獲了以前的模型沒有覆蓋的CFGs，包括PIK3CA和RPS6KA3（圖S2C）。對于LIMORE未檢測到的CFGs，其在原發(fā)性癌癥中的突變頻率均低于5%。

LIMORE中觀察到了原發(fā)性肝癌中常見的CFGs，如TERT和Wnt信號通路的變異。所有肝癌中常見的TERT變異在LIMORE中均有發(fā)現(xiàn)。與原發(fā)性肝癌相一致，LIMORE中的TERT啟動子突變和HBV整合是互斥的。超過30%的LIMORE模型和原發(fā)性肝癌中以互斥方式出現(xiàn)了Wnt信號通路基因（CTNNB1、AXIN1和APC）的變異。AXIN1（15/15）和APC（3/6）的功能喪失變異明顯增加，而9個(gè)CTNNB1變異中有8個(gè)激活突變。MHCC-97H攜帶CTNNB1密碼子500處的雜合性無義突變，但未增加β-catenin靶基因的表達(dá)。此外，在LIMORE模型中還發(fā)現(xiàn)了潛在的治療靶點(diǎn)的變異，如FGF19和MET。

如何根據(jù)肝癌患者的基因型差異選擇正確治療靶向藥物？

建立了可以反映肝癌患者基因突變多樣性的正確治療解碼平臺后，佳學(xué)基因利用LIMORE中進(jìn)行了體外藥物篩選。共收集了90種抗癌藥物，包括15種化療藥物和75種分子靶向藥物，針對9種細(xì)胞功能。其中大多數(shù)藥物已獲得臨床批準(zhǔn)（n=43）或處于臨床試驗(yàn)階段（n=32）。對這些藥物，佳學(xué)基因?qū)λ?1個(gè)LIMORE模型進(jìn)行了篩選，每種藥物進(jìn)行了7或10個(gè)劑量，生成了超過218,000個(gè)細(xì)胞-藥物相互作用的測量結(jié)果。在871個(gè)篩選板中，用作魯棒性控制的平均Z-prime值為0.84，99%的板中Z-prime值大于0.5，表明篩選實(shí)驗(yàn)具有實(shí)驗(yàn)魯棒性。腫瘤靶向藥物基因計(jì)算了半數(shù)抑制濃度（IC50）、最大效應(yīng)水平（Emax）和活動區(qū)域（AA）來反映LIMORE模型的藥物反應(yīng)（附表S4），這些指標(biāo)彼此之間具有良好的相關(guān)性（圖S3C）。在隨機(jī)選擇的22個(gè)LIMORE模型的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)之間的一致性很高（Pearson r = 0.91，p < 2.2e-16，圖S3D）。此外，在18種藥物的一個(gè)面板中對6個(gè)已建立的模型（>20個(gè)細(xì)胞傳代）和相應(yīng)的早期傳代細(xì)胞（<10個(gè)細(xì)胞傳代）進(jìn)行測試時(shí)觀察到了藥物反應(yīng)的強(qiáng)相關(guān)性，這可能反映了LIMORE模型在細(xì)胞傳代過程中對基因組景觀的保持。值得注意的是，通過比較CTRP或GDSC中也進(jìn)行了特征化的52種藥物和21個(gè)細(xì)胞模型，肝癌的基因解碼發(fā)現(xiàn)這些藥物的反應(yīng)譜在不同研究中是可比較的。佳學(xué)基因還分析了Y-27632的影響，并發(fā)現(xiàn)總體的藥物反應(yīng)譜并未受到Y(jié)-27632的改變。在Y-27632培養(yǎng)的模型中未富集任何信號通路。有趣的是，某些源自Y-27632的模型對紫杉醇的反應(yīng)似乎稍有影響。

LIMORE模型之間的藥物反應(yīng)譜有所差異。藥物反應(yīng)的大幅變化（變異系數(shù)范圍從0.25到3.14）以及基因的多樣性使肝癌的靶向藥物基因檢測能夠發(fā)現(xiàn)與藥物反應(yīng)相關(guān)的遺傳標(biāo)記。聚類分析確定了LIMORE模型的兩個(gè)簇。簇R通常對藥物具有更強(qiáng)的耐藥性，而簇S則更為敏感。雖然一些簇S模型富集了與DNA修復(fù)相關(guān)的基因，但對于簇S的常見敏感機(jī)制并不明顯。與簇R的耐藥表型一致，藥物解毒和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因在簇R中富集。這些數(shù)據(jù)表明，相當(dāng)一部分肝癌在本質(zhì)上可能對多種藥物具有耐藥性，這可能是由于它們高藥物轉(zhuǎn)化能力。當(dāng)根據(jù)HBV感染狀態(tài)將模型分開時(shí)，佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)HBV陽性細(xì)胞模型對阿霉素和表柔比星的敏感性較低，但對依布替尼的敏感性較高，相比之下，HBV陰性模型則相反。

具有相似作用機(jī)制（MoA）的藥物顯示出相關(guān)的反應(yīng)譜，這表明了藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)的高效能。佳學(xué)基因確定了一組在至少25%的LIMORE模型中具有IC50 < 1 µM的強(qiáng)抑制效果的藥物，其中包括阿霉素和托泊替康等化療藥物，這可能反映了它們的一般細(xì)胞靜止效果。有趣的是，用于HCC治療的靶向藥物，包括索拉非尼、雷格歐非尼和樂伐替尼，并未出現(xiàn)在這個(gè)列表中，這可能與它們在HCC患者中的相對低反應(yīng)率有關(guān)。然而，佳學(xué)基因在LIMORE模型中發(fā)現(xiàn)了其他具有強(qiáng)效的靶向藥物，包括達(dá)沙替尼和科比替尼。盡管這些藥物在肝癌中的分子基礎(chǔ)尚不明確，但這些數(shù)據(jù)提供了用于肝癌治療的藥物候選和再利用的機(jī)會。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LIMORE中的高通量藥物篩選捕獲了不同的藥物反應(yīng)，并為肝癌的藥物基因組學(xué)分析提供了機(jī)會。

肝癌的藥物基因組學(xué)分析

為了捕捉LIMORE模型之間多樣化的藥物反應(yīng)模式，肝癌正確用藥基因解碼制定了藥物反應(yīng)評分（DRS）體系，它是IC50、Emax和AA中最變化參數(shù)的歸一化z-score。為了明確CFG和表達(dá)特征在藥物基因組學(xué)中的作用，腫瘤靶向藥物基因檢測利用彈性網(wǎng)絡(luò)（EN）模型從1,000次自助重采樣中推斷出對藥物反應(yīng)具有穩(wěn)健預(yù)測能力的特征。EN分?jǐn)?shù)閾值設(shè)置為0.60，表示該特征在超過60%的自助重采樣中被選擇。對于每種藥物，平均識別出了54個(gè)突變特征（23個(gè)CFG和31個(gè)非編碼突變）和249個(gè)表達(dá)特征作為藥物的預(yù)測因素。值得注意的是，預(yù)測特征包括已知的基因-藥物關(guān)聯(lián)，如MRP1-順鉑和SLC35F2-YM155的關(guān)聯(lián)。

總體而言，肝部腫瘤的基因解碼確定了1,508個(gè)CFG-藥物對之間的顯著相互作用，其中有56對與索拉非尼、雷格歐非尼和樂伐替尼等已批準(zhǔn)的肝癌藥物的反應(yīng)相關(guān)?？偣?，727個(gè)CFG-藥物對與藥物耐藥性相關(guān)，而781個(gè)CFG-藥物對則預(yù)測藥物敏感性。有趣的是，肝癌腫瘤基因檢測發(fā)現(xiàn)TERT啟動子中的HBV整合與藥物耐藥性相關(guān)，而TERT啟動子突變對大部分藥物呈現(xiàn)敏感性。由于在特定分析HBV陽性模型時(shí)得到了類似的結(jié)果，這個(gè)發(fā)現(xiàn)不太可能是由HBV感染引起的一般性病因所致。根據(jù)上述結(jié)果，LIMORE提供了一系列的CFG-藥物相互作用，這些相互作用可以從數(shù)據(jù)集中方便地檢索，并且可以進(jìn)一步作為生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。

FGF/FGFR與抗癌藥物之間的相互作用在CFG-藥物相互作用列表中排名靠前。包括樂伐替尼、BGJ398和PD173074在內(nèi)的FGFR抑制劑對于FGFR（包括FGFR1、3和4，拷貝數(shù)≥4）和FGF19擴(kuò)增的肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出選擇性敏感性。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)GF19和FGFR擴(kuò)增可能作為樂伐替尼的生物標(biāo)志物。與FGF19擴(kuò)增在MAPK通路激活中的作用一致，F(xiàn)GF19擴(kuò)增與MEK抑制劑（MEKi）cobimetinib和trametinib的敏感性相關(guān)。值得注意的是，MEKi誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡表現(xiàn)為細(xì)胞膜上產(chǎn)生大氣泡，這是焦亡（pyroptosis）的一種典型特征。相應(yīng)地，對MEKi的敏感性與GSDME的高表達(dá)（焦亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）適度相關(guān)。雖然單獨(dú)的FGF19擴(kuò)增或GSDME過表達(dá)可以預(yù)測對MEKi的敏感性，但同時(shí)具有FGF19擴(kuò)增和高GSDME表達(dá)的細(xì)胞模型對MEKi非常敏感。GSDME表達(dá)的減少導(dǎo)致FGF19擴(kuò)增模型對MEKi的敏感性降低。這些數(shù)據(jù)共同表明，MEK抑制劑對具有FGF19擴(kuò)增和GSDME過表達(dá)的肝癌呈現(xiàn)特定脆弱性。

如何通過肝癌靶向藥物基因檢測找到具有合成致死相互作用的藥物

一些CFGs，例如CTNNB1，被認(rèn)為是無法治療的，但如果能夠建立適當(dāng)?shù)暮铣芍滤老嗷プ饔?，就可以利用它們進(jìn)行治療。一簇藥物被發(fā)現(xiàn)更傾向于消除具有CTNNB1活化突變的LIMORE模型。CTNNB1活化突變與對HDAC抑制劑（如panobinostat、vorinostat和belinostat）的敏感性相關(guān)（Cohen's d分別為0.69、0.67和0.43），這與HDAC在β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)中的作用需求一致（Billin et al., 2000）。HDAC可能在介導(dǎo)藥物敏感性方面具有冗余功能，因?yàn)閱蝹€(gè)HDAC的敲除似乎不會明顯影響β-連環(huán)蛋白活化模型的細(xì)胞增殖（圖S5A）。在β-連環(huán)蛋白野生型模型中表達(dá)一個(gè)持續(xù)活化的β-連環(huán)蛋白形式增加了對HDAC抑制劑的敏感性。當(dāng)在體內(nèi)移植時(shí)，panobinostat抑制了CTNNB1突變模型的生長，但未抑制CTNNB1野生型模型的生長。此外，過度表達(dá)活化的β-連環(huán)蛋白賦予了CTNNB1野生型JHH7對panobinostat的敏感性。這些數(shù)據(jù)表明，HDAC抑制劑是一種潛在的靶向具有CTNNB1活化突變的HCCs的策略。

MYC是HCC中另一個(gè)無法治療的致癌蛋白。佳學(xué)基因解碼收集的證據(jù)表明，Wnt通路與MYC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄在肝母細(xì)胞瘤和結(jié)直腸癌中存在相互作用。實(shí)際上，通過分析TCF4/7和MYC的已發(fā)表的ChIP-Seq數(shù)據(jù)，肝癌腫瘤靶向藥物基困檢測發(fā)現(xiàn)Wnt靶點(diǎn)顯著地被TCF4/7和MYC共同結(jié)合。通過基于轉(zhuǎn)錄因子的分析，佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)MYC調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序與對HDAC抑制劑的敏感性相關(guān)（Cohen's d分別為0.91、0.60和1.18）。通過MYC的過度表達(dá)驗(yàn)證了對HDAC抑制劑的增強(qiáng)敏感性。當(dāng)評估HDAC抑制劑的預(yù)測能力時(shí)，MYC調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序似乎與CTNNB1突變相當(dāng)或略強(qiáng)（75%–81.8% vs 62.5%–75%）。這些數(shù)據(jù)共同顯示，在LIMORE中，可以通過藥物基因組學(xué)的方法尋找針對肝癌中無法治療的致癌基因的潛在合成致死策略。

肝癌靶向藥物基因檢測如何確定使用索拉非尼的生物標(biāo)志物

由于索拉非尼是HCC的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，與索拉非尼相關(guān)的CFGs和基因表達(dá)具有很大的研究價(jià)值。佳學(xué)基因找到了51個(gè)與索拉非尼相關(guān)的突變特征（18個(gè)CFGs和33個(gè)非編碼突變）和77個(gè)表達(dá)特征，可以預(yù)測索拉非尼的響應(yīng)。在與索拉非尼耐藥性預(yù)測最相關(guān)的CFG特征中，KEAP1是一個(gè)重要的候選者。KEAP1的突變與NRF2信號通路的激活和索拉非尼耐藥性相關(guān)。事實(shí)上，NRF2的下游靶點(diǎn)在KEAP1突變的LIMORE模型中高度表達(dá)。此外，NRF2的沉默增加了KEAP1突變模型對索拉非尼的敏感性，支持了KEAP1/NRF2通路在索拉非尼耐藥性中的作用。佳學(xué)基因還發(fā)現(xiàn)了與索拉非尼敏感性相關(guān)的表達(dá)特征。以EZH2表達(dá)為例，EZH2的高表達(dá)與對索拉非尼的敏感性密切相關(guān)。通過EZH2的沉默表明，EZH2的高表達(dá)增加了對索拉非尼的抵抗性。通過DZNep對EZH2進(jìn)行藥物抑制，在46個(gè)LIMORE模型中的33個(gè)模型中顯示出與索拉非尼對抗效應(yīng)（CDI>1），進(jìn)一步暗示了EZH2的過度表達(dá)可能與索拉非尼協(xié)同作用。總的來說，這些數(shù)據(jù)揭示了與索拉非尼敏感性相關(guān)的分子特征。

腫瘤的正確用藥基因檢測接下來探索藥物基因組學(xué)模式是否能夠轉(zhuǎn)化為索拉非尼的預(yù)測模型或生物標(biāo)志物。佳學(xué)基因基于LIMORE模型中與響應(yīng)相關(guān)的突變和表達(dá)特征開發(fā)了彈性網(wǎng)回歸模型。預(yù)測性能通過LIMORE中預(yù)測和檢測到的響應(yīng)之間的Spearman相關(guān)性進(jìn)行評估。為了在體內(nèi)評估預(yù)測模型，肝癌正確用藥基因解碼使用22個(gè)接受索拉非尼治療的HCC PDX模型的獨(dú)立數(shù)據(jù)集分析了索拉非尼的預(yù)測模型，并發(fā)現(xiàn)預(yù)測響應(yīng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間存在顯著相關(guān)性。

然后，肝部腫瘤正確治療基因解碼搜索了潛在的臨床實(shí)踐生物標(biāo)志物候選者。其中DKK1引起了特別的興趣，因?yàn)樗婕癢nt信號通路。佳學(xué)基因首先在PDX模型中評估了DKK1的預(yù)測能力。通過ROC分析確定了在PDX中區(qū)分高和低DKK1 mRNA水平的最佳截?cái)帱c(diǎn)。值得注意的是，DKK1水平高的PDX模型對索拉非尼的響應(yīng)率增加，這表明DKK1表達(dá)可能能夠預(yù)測索拉非尼在體內(nèi)的反應(yīng)。

然后，靶向藥物基因檢測基因解碼調(diào)查了DKK1是否可能成為預(yù)測患者索拉非尼反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。DKK1是一種可在血清中測量的分泌蛋白，因此佳學(xué)基因分析了患者血清DKK1水平與其索拉非尼反應(yīng)之間的相關(guān)性?；仡櫺允占?4名HCC患者的索拉非尼治療前或治療后的血清樣本，并測量了DKK1水平。DKK1高水平組的患者具有更長的無進(jìn)展生存期和總生存期。當(dāng)只分析索拉非尼治療前收集血清樣本的患者時(shí)，觀察到類似的趨勢?？紤]到高DKK1表達(dá)與未接受索拉非尼治療的HCC患者的不良生存率相關(guān)，這些數(shù)據(jù)表明DKK1可能是選擇對索拉非尼有反應(yīng)的患者的血清生物標(biāo)志物。

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)

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