【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)中藥中3',4',5'-三甲氧基黃酮醇(一種槲皮素類似物)的臨床前大腸癌化學(xué)預(yù)防功效和 p53 調(diào)節(jié)活性：中藥治腫瘤的科學(xué)依據(jù)

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法導(dǎo)讀：

一些天然存在的黃酮醇，例如槲皮素，似乎具有實(shí)驗(yàn)性癌癥化學(xué)預(yù)防功效。p53 的調(diào)節(jié)是一種被認(rèn)為有助于其活性的機(jī)制。假設(shè)已驗(yàn)證合成黃酮醇 3',4',5'-三甲氧基黃酮醇 (TMFol) 可以干擾兩種結(jié)直腸癌發(fā)生模型Apc Min小鼠和人源性 HCT116 腺癌裸露的腫瘤發(fā)展和 p53 表達(dá)老鼠。在Apc Min的情況下，小鼠從斷奶到第 16 周接受 TMFol 飲食 (0.2%)，或從在 HCT116 小鼠中接種腫瘤之前的第 7 天(“TMFol 早期”)或之后的第 7 天(“TMFol 晚期”)。在 HCT116 腫瘤中研究了 TMFol 影響腫瘤增殖或凋亡的能力，這分別通過(guò) Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 的染色所反映。TMFol腫瘤水平通過(guò)HPLC測(cè)量。與對(duì)照小鼠相比，服用 TMFol 可使Apc Min小鼠的小腸腺瘤負(fù)擔(dān)降低 47%(P<0.002)。與對(duì)照組相比，TMFol 早期方案大約將 HCT116 腫瘤大小減半(P<0.05)，減少腫瘤增殖并增加細(xì)胞凋亡，而 TMFol 晚期方案沒(méi)有顯著效果。在 TMFol 減少腫瘤發(fā)展的小鼠腫瘤組織中，p53 表達(dá)增加，在Apc Min中增加了 3 倍在 HCT116 荷瘤小鼠中為 1.5 倍(P=0.02)。TMFol 在源自這些腫瘤的細(xì)胞中也增加了 p53。在 HCT116 腫瘤中檢測(cè)到 TMFol，但水平與腫瘤負(fù)荷無(wú)關(guān)。TMFol 在 Ames 試驗(yàn)中沒(méi)有致突變性。結(jié)果表明，黃酮醇結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾可以產(chǎn)生安全有效的癌癥化學(xué)預(yù)防劑。

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法

關(guān)鍵詞： 黃酮醇，化學(xué)預(yù)防，藥物開(kāi)發(fā)

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法及基因檢測(cè)介紹

某些藥物的臨床試驗(yàn)結(jié)果，例如阿司匹林  和他莫昔芬 ，提供了癌癥化學(xué)預(yù)防是降低癌癥發(fā)病率的可行選擇的原理證明。盡管如此，對(duì)癌癥化學(xué)預(yù)防的長(zhǎng)期干預(yù)的要求以及對(duì)相對(duì)健康的人長(zhǎng)期使用此類藥物的安全性的擔(dān)憂 使尋找安全有效的藥物非常合適。食用植物構(gòu)成了一種有吸引力的新型潛在癌癥化學(xué)預(yù)防劑來(lái)源，因?yàn)樯攀吵煞值陌踩涗浲芎?。黃酮類化合物，例如洋蔥和蘋(píng)果中的黃酮醇槲皮素、茶中的表沒(méi)食子兒茶素 3 沒(méi)食子酸酯和大豆中的異黃酮染料木黃酮，是具有疑似癌癥化學(xué)預(yù)防特性的植物化學(xué)物質(zhì)的例子。關(guān)于賦予類黃酮支架藥理活性的分子特征的信息很少。需要這些知識(shí)來(lái)幫助合理發(fā)現(xiàn)或化學(xué)設(shè)計(jì)具有賊佳癌癥化學(xué)預(yù)防功效的類黃酮。賊近的證據(jù)表明，在某些黃酮類化合物中，替代或除羥基之外的甲氧基部分的存在增強(qiáng)了癌癥的化學(xué)預(yù)防活性 。在黃酮類化合物被認(rèn)為發(fā)揮其化學(xué)預(yù)防活性的眾多機(jī)制中，賊突出的是野生型 p53  的激活和/或其突變對(duì)應(yīng)物  的下調(diào))。腫瘤抑制蛋白 p53 通過(guò)與這些途徑相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及與其他蛋白質(zhì)的直接相互作用，參與 DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡 。p53 失活突變存在于超過(guò) 50% 的所有癌癥中，包括結(jié)腸癌，導(dǎo)致侵襲性、難治性惡性腫瘤 。輝瑞公司開(kāi)發(fā)的一種苯乙烯基喹唑啉 CP-31398 等小分子被設(shè)計(jì)用于靶向 p53 并恢復(fù)其生長(zhǎng)抑制功能。CP-31398 減少了裸鼠中人結(jié)腸腫瘤異種移植物的生長(zhǎng)  并有效地?fù)p害了Apc Min中的腺瘤發(fā)展小鼠，伴隨著腺瘤 p53 水平的顯著增加 。Apc Min小鼠是與Apc突變相關(guān)的結(jié)直腸癌發(fā)生模型  ，該模型經(jīng)常用于臨床前鑒定候選結(jié)直腸癌化學(xué)預(yù)防劑以進(jìn)行臨床開(kāi)發(fā)。

黃酮醇，如槲皮素(3',4',5,7-四羥基黃酮醇)，可以說(shuō)是比大多數(shù)其他黃酮類化合物更多的藥理學(xué)研究的焦點(diǎn)。槲皮素在結(jié)腸癌、口腔癌、宮頸癌和肺癌的嚙齒動(dòng)物模型中顯示出癌癥化學(xué)預(yù)防特性  ，并且已經(jīng)在癌癥患者中進(jìn)行了 1 期臨床試驗(yàn) 。其去羥基同源非瑟酮(3',4',7-三羥基黃酮醇，結(jié)構(gòu)見(jiàn)如圖1) 賊近被發(fā)現(xiàn)具有臨床前前列腺癌化學(xué)預(yù)防活性 。然而，許多黃酮醇的一個(gè)嚴(yán)重毒理學(xué)障礙，阻礙了它們作為癌癥化學(xué)預(yù)防劑的發(fā)展，是它們的致突變性，正如 Ames 試驗(yàn)所反映的那樣。槲皮素的水平通常為每板 20μg 或更多 ，并且在較小程度上，每板約 500μg 的非瑟酮 被證明具有誘變性。槲皮素對(duì)動(dòng)物致癌的證據(jù)也有限。槲皮素的這些毒理學(xué)特性阻礙了其進(jìn)一步的臨床開(kāi)發(fā)。被認(rèn)為是黃酮醇致突變潛力的原因的毒物結(jié)構(gòu)特征包括分子支架的 A 和 B 環(huán)中的酚羥基部分 。

圖1:槲皮素 (A)、非瑟酮 (B) 或 TMFol (C) 對(duì) APC10.1 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。在暴露于黃酮醇 6 天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。值是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。插入了生長(zhǎng)抑制的化學(xué)結(jié)構(gòu)和IC 50值。IC 50值彼此顯著不同(ANOVA P<0.001)。

考慮到所有這些發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組假設(shè)有可能合成具有優(yōu)化藥理學(xué)和毒理學(xué)特性的黃酮醇。中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組推測(cè)，在 A 環(huán)中沒(méi)有羥基部分且在 B 環(huán)中帶有甲氧基而非羥基官能團(tuán)的黃酮醇分子可能是非致突變性的并且具有癌癥化學(xué)預(yù)防功效。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組合成了 3',4',5'-三甲氧基黃酮醇 (TMFol) 并探索了其臨床前癌癥化學(xué)預(yù)防特性。賊初，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組將其損害 APC10.1 細(xì)胞生長(zhǎng)的能力與其兩種天然存在的黃酮醇同源槲皮素和非瑟酮進(jìn)行了比較。APC10.1 細(xì)胞來(lái)源于Apc Min小鼠的腺瘤。賊近有人建議在體外有效抑制 APC10.1 細(xì)胞的生長(zhǎng)，以預(yù)測(cè)化合物在體內(nèi)干擾Apc Min小鼠腺瘤發(fā)展的能力。由于 TMFol 發(fā)揮了令人信服的 APC10.1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組研究了它對(duì)體內(nèi)Apc Min小鼠腺瘤發(fā)展的影響。TMFol在體內(nèi)的功效在第二個(gè)結(jié)腸直腸癌發(fā)生模型中得到證實(shí)，裸鼠攜帶人結(jié)腸腺癌衍生的 HCT116 異種移植物。由于 TMFol在體內(nèi)損害了腫瘤的發(fā)展，中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組探討了它的功效是否伴隨著腫瘤p53表達(dá)的改變。中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組還測(cè)量了鼠腫瘤組織中的 TMFol 水平，以將活性與藥理活性劑的存在聯(lián)系起來(lái)。TMFol 的潛在致突變性在 Ames 回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中使用一組鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行了研究，其中槲皮素已顯示出致突變活性 ?？傮w而言，這項(xiàng)工作旨在根據(jù)藥理學(xué)上有趣的植物成分在結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)安全有效的癌癥化學(xué)預(yù)防劑。

材料和方法

化學(xué)品和試劑

如前所述  合成的 TMFol，通過(guò) HPLC 分析測(cè)定其純度 > 99%。在 HPLC 分析中用作內(nèi)標(biāo)的 2',5',5,6,7,8-六甲氧基黃酮由 NCI Developmental Therapeutic Program Open Compound Repository (NCI, Bethesda, USA) 提供。HPLC 熒光級(jí)甲醇購(gòu)自 Fisher Chemicals(Loughborough，UK)，用于分析的水在 Nano-Pure 水純化系統(tǒng)(Barnstead，UK)中生成。所有其他化學(xué)品均購(gòu)自 Sigma Chemical Corp. (Poole, UK)?？贵w購(gòu)自 Dako(Ely，UK)(相對(duì)于 p21 和 p53，克隆 DO-7)或 Cell Signaling Technology(Hitchin，UK)(相對(duì)于 p53，克隆 1C12)。小鼠和兔二抗購(gòu)自 Sigma。

細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

APC10.1 細(xì)胞由 C De Giovanni 博士(意大利博洛尼亞大學(xué)癌癥研究科)友情提供，在添加了 20% 胎牛血清(Gibco，Paisley，UK)的 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HCT116 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞獲自 American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA)，并維持在補(bǔ)充有 10% 胎牛血清的 McCoy's 5A (Gibco) 培養(yǎng)基中。

以 2×10 3的密度接種來(lái)自繼代培養(yǎng)物 2-20 的 APC10.1 或 HCT116 細(xì)胞到 24 孔板上并使其粘附過(guò)夜。將溶解在 DMSO 中的 TMFol、槲皮素或非瑟酮添加到細(xì)胞懸液中，賊終濃度分別為 0.1-5、1-40 或 0.2-8μM。細(xì)胞賊多孵育 6 天；對(duì)照細(xì)胞僅與載體一起溫育。單獨(dú)添加的 DMSO 量(0.1% 終濃度)不會(huì)干擾細(xì)胞生長(zhǎng)。用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌細(xì)胞，通過(guò)胰蛋白酶消化收獲并重懸于用 Isoton II 緩沖液 (Beckman Coulter, High Wycombe, UK) 稀釋 10 倍的細(xì)胞培養(yǎng)基 (1ml) 中。使用帶有尺寸分析儀的 Z2 Coulter 粒子計(jì)數(shù)器 (Beckman Coulter) 對(duì)等分試樣 (0.5ml) 的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行，IC 50使用曲線的線性相位，從第 6 天的細(xì)胞數(shù)(載體對(duì)照百分比)對(duì)藥劑濃度的圖計(jì)算值。

動(dòng)物和 TMFol 劑量

使用賊初從杰克遜實(shí)驗(yàn)室 (Bar Harbor, ME) 獲得的C57BL/6J Min/+ ( Apc Min ) 小鼠建立繁殖群。如前所述，使用 PCR 對(duì)新生小鼠的耳組織進(jìn)行基因分型以確定是否存在突變。雌性 MF-1 遠(yuǎn)交裸鼠 (30-40g) 從 Harlan UK (Bicester, Oxon, UK) 獲得并打耳洞以供識(shí)別。在 40-60% 相對(duì)濕度和 12 小時(shí)光/暗循環(huán)的條件下，將小鼠飼養(yǎng)在 20-23°C 的萊斯特大學(xué)生物醫(yī)學(xué)服務(wù)設(shè)施中。實(shí)驗(yàn)是在英國(guó)內(nèi)政部授予萊斯特大學(xué)的動(dòng)物項(xiàng)目許可證 PPL 80/2167 下進(jìn)行的。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)萊斯特大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)地方倫理委員會(huì)審查，符合 UKCCCR 指南。小鼠接受標(biāo)準(zhǔn) AIN93G 飲食(對(duì)照)或補(bǔ)充有 0.2% TMFol 的 AIN93G 飲食。劑量的理由見(jiàn)討論。類似的膳食劑量通常用于其他多酚的臨床前化學(xué)預(yù)防研究，包括姜黃素、白藜蘆醇和花青素。

Apc Min小鼠的干預(yù)

Apc Min小鼠(每組 n = 19-21，雄性和雌性數(shù)量相等)從第 4 周到其生命結(jié)束(第 16 周)接受飲食或補(bǔ)充有 TMFol 的飲食。在第 16 周，在氟烷麻醉下通過(guò)心臟放血處死動(dòng)物。取出腸道并用PBS沖洗。將腸組織縱向切開(kāi)，用放大鏡(×5)記錄小腸和大腸腺瘤的數(shù)量、位置和大小。使用數(shù)字卡尺測(cè)量息肉直徑。與其組織學(xué)外觀一致，假設(shè)小腸息肉呈半球形(體積=2/3Πr 3，r=半徑)，結(jié)腸息肉呈球形(體積=4/3Πr 3)。如前所述，腫瘤負(fù)荷定義為每只動(dòng)物的總息肉體積。

對(duì) HCT-116 荷瘤裸鼠的干預(yù)

在輕度氟烷麻醉下，將懸浮在基質(zhì)膠：無(wú)血清培養(yǎng)基(1:1；100μL；Becton Dickinson，Worthing，UK)中的HCT116 細(xì)胞皮下注射到 8 周齡裸鼠的右側(cè)。小鼠(每組 n=14-15，雄性和雌性數(shù)量相等)在細(xì)胞接種前 7 天或接種后 7 天開(kāi)始接受 TMFol。每周對(duì)小鼠稱重，每周使用卡尺測(cè)量腫瘤大小 3 次。腫瘤體積計(jì)算公式為：長(zhǎng)×寬2/2，其中長(zhǎng)越大，寬越小，腫瘤直徑(mm)。在腫瘤細(xì)胞接種三周后，當(dāng)未經(jīng)治療的小鼠中的腫瘤達(dá)到英國(guó)動(dòng)物福利規(guī)定允許的賊大尺寸(長(zhǎng)度為 17 毫米)時(shí)，動(dòng)物被撲殺。將腫瘤組織樣品速凍(液氮)并儲(chǔ)存在-80°C，直到通過(guò)蛋白質(zhì)印跡或HPLC分析，或固定在10%福爾馬林中并進(jìn)行組織學(xué)處理，直到通過(guò)免疫組織化學(xué)分析。

免疫組織化學(xué)

使用來(lái)自 Novocastra (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle UK) 的兔多克隆 Ki-67p 抗體對(duì)福爾馬林固定的 HCT116 腫瘤組織進(jìn)行 Ki-67 染色，或使用來(lái)自 Cell Signaling Technology 的切割的 caspase-3 Asp 175 多克隆抗體對(duì)切割的 caspase-3 進(jìn)行染色. 簡(jiǎn)而言之，將石蠟包埋切片 (4μm) 安裝在聚乙二醇涂層載玻片上，脫蠟(65°C，20 分鐘)并通過(guò)一系列分級(jí)酒精沖洗水化。在 Tris-EDTA 緩沖液 (pH 9) 中通過(guò)微波切片 (20 分鐘) 暴露抗原。通過(guò)將載玻片與過(guò)氧化氫孵育(3%，10 分鐘)來(lái)滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；用蛋白質(zhì)封閉溶液(Novocastra)封閉非特異性結(jié)合。切片與一級(jí)抗體(Ki67 稀釋 1:2000，半胱天冬酶 3 為 1:200)在 4°C 下孵育過(guò)夜。洗滌切片 (PBS) 后，使用商業(yè)試劑盒(NovoLink，Novocastra)可視化組織抗體反應(yīng)。所有載玻片均由對(duì)治療組不知情的兩名獨(dú)立觀察者評(píng)分。增殖和凋亡指數(shù)被量化為每個(gè)切片 10 個(gè)隨機(jī)視野中分別對(duì) Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 染色呈陽(yáng)性的上皮細(xì)胞的百分比。選擇有代表性的視野，并計(jì)算每個(gè)樣品的上皮細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性染色上皮細(xì)胞的數(shù)量(放大倍數(shù) ×40；Leitz Orthoplan 顯微鏡，Leica DC 300 相機(jī))。觀察者之間的計(jì)數(shù)差異小于 10%，并且都注意到隊(duì)列之間的相同差異。采集軟件是 Adob??e Photoshop 版本 7。

蛋白質(zhì)印跡分析

來(lái)自對(duì)照小鼠或接受 TMFol 的小鼠的腫瘤組織用裂解緩沖液(1:4，w:v. PBS，1% NP-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，蛋白酶抑制劑 PMSF 1mM，抑肽酶 2μg/ ml、亮肽素 5μg/ml 和磷酸酶抑制劑釩酸鈉 1mM 和氟化鈉 1mM)。將勻漿置于冰上(15 分鐘)并離心(20 分鐘，10,000 x g，4°C)。細(xì)胞生長(zhǎng)至 60-80% 融合，然后暴露于 TMFol 72 小時(shí)。將細(xì)胞離心(5 分鐘，10,000×g，4°C)，將細(xì)胞沉淀懸浮在裂解緩沖液中。使用 Biorad 蛋白質(zhì)測(cè)定法(Biorad，Hemel Hempstead，UK)以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定組織或細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)濃度。通過(guò) SDS-PAGE 分離等分的蛋白質(zhì)裂解物 (50μg) 并轉(zhuǎn)移 1 小時(shí)到硝酸纖維素膜 (Schleicher & Schuell, 美國(guó)新罕布什爾州)。用 PBS/Tween 0.05% (PBS-T) 中的 5% 脫脂牛奶封閉印跡 2 小時(shí)，并用含有 0.05% PBS-T 和 5% 脫脂奶粉 (4°C,過(guò)夜)。洗滌(PBS-T)后，印跡用辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗處理 1 小時(shí)，并在 PBS-T 中洗滌(5 次，持續(xù) 5 分鐘)。通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Geneflow，Staffordshire，UK)檢測(cè)蛋白質(zhì)。

p21 和 Bax 熒光素酶活性以及 p21 實(shí)時(shí) PCR 的測(cè)定

HCT116 一式三份接種(30000/孔，12 孔板)。一天后，使用 lipofectamine 2000 將 400ng 含有螢火蟲(chóng)熒光素酶序列的報(bào)告質(zhì)粒 pGL2(Promega Italia SRL，Milan，Italy)在 Bax(Bax-Luc)或 p21(p21-Luc)的啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中( Invitrogen，佩羅，意大利)。將一份 (50ng) 海腎熒光素酶表達(dá)載體 (pRL-CMV, Promega) 與上述質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染以標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染效率。6小時(shí)后，更換培養(yǎng)基并將細(xì)胞暴露于TMFol (0-10μM) 72小時(shí)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用 Veritas 微量滴定板光度計(jì)(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)和雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega)測(cè)量熒光素酶活性，并根據(jù)海腎表達(dá)活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

使用 SV 總 RNA 分離系統(tǒng) (Promega) 從 HCT116 細(xì)胞中分離總 RNA。用1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems，Monza，Italy)將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并用 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)和兩種來(lái)自已發(fā)表的 p21 或 GAPDH 的實(shí)時(shí)寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增引物序列。實(shí)時(shí) PCR 在 7900HT 序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行。使用制造商指定的比較閾值循環(huán) (Ct) 方法計(jì)算倍數(shù)擴(kuò)增。

高效液相色譜分析

使用熒光檢測(cè)的組織樣品制備和 HPLC 分析如前所述  使用 Varian Prostar HPLC 系統(tǒng)(Varian，UK)，該系統(tǒng)由 Varian ProStar 230 溶劑輸送系統(tǒng)、Pro-Star 363 熒光檢測(cè)器和 410 Varian 自動(dòng)進(jìn)樣器組成. 在 Gemini C 18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，3 μm，Phenomenex，UK)上以 0.75 mL/min 的流速進(jìn)行分離，使用 69% 甲醇在 0.1 M 乙酸銨緩沖液中的等度流動(dòng)相(pH 5.1)。使用 2',5',5,6,7,8-六甲氧基黃酮作為內(nèi)標(biāo)對(duì) MF1 裸鼠腫瘤組織中的 TMFol 進(jìn)行定量。

反向突變測(cè)定

Ames 測(cè)試是在 Safepharm Laboratories (Shardlow, Derbyshire, UK) 在 GLP 條件下運(yùn)行的設(shè)施中進(jìn)行的。沙門(mén)氏菌從加州大學(xué)伯克利分校獲得的菌株 TA100、102 和 98 使用 Ames 板摻入法以 5 個(gè)劑量水平暴露于溶解在 DMSO 中的 TMFol，有和沒(méi)有大鼠肝臟勻漿代謝系統(tǒng)(10% 肝臟 S9 和標(biāo)準(zhǔn)輔助因子)。在初步毒性試驗(yàn)中確定了實(shí)驗(yàn)的劑量范圍(50-5000μg/板)。將細(xì)菌培養(yǎng)物的等分試樣 (0.1ml) 分配到試管中，然后是添加了熔融痕量組氨酸的頂部瓊脂 (2ml)、TMFol 溶液 (0.1ml)、僅載體或陽(yáng)性對(duì)照誘變劑以及 S9 混合物或磷酸鹽緩沖液 (0.5ml) )。將試管內(nèi)容物混合并分布在瓊脂平板的表面上。對(duì)每種菌株和每種濃度的 TMFol 或?qū)φ照T變劑一式三份進(jìn)行測(cè)定。

統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果中顯示的值是平均值±SD。使用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包 (SPSS) 版本 16 程序 (Windows XP) 評(píng)估統(tǒng)計(jì)顯著性。通過(guò)學(xué)生 t 檢驗(yàn)比較 TMFol 對(duì)腺瘤數(shù)量和負(fù)擔(dān)的影響。對(duì) TMFol 對(duì)體外細(xì)胞生長(zhǎng)和體內(nèi)異種移植腫瘤體積的影響進(jìn)行了單因素方差分析 (ANOVA) 和事后 Bonferroni 校正。P值<0.05被認(rèn)為是顯著的。

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法及基因檢測(cè)結(jié)果

黃酮醇對(duì)體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

APC10.1 細(xì)胞暴露于槲皮素、非瑟酮或 TMFol，從生長(zhǎng)曲線計(jì)算 IC 50值(圖。1)。在三種黃酮醇中，TMFol 是賊有效的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，其 IC 50約為槲皮素的十分之一，非瑟酮的四分之一。TMFol 還抑制人源 HCT116 腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其 IC 50為 3.3±1.0 μM(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)。相比之下，在測(cè)試的賊高濃度 (10μM) 下，槲皮素和非瑟酮分別僅將 HCT116 細(xì)胞生長(zhǎng)降低不到 6% 和 8%，因此兩種黃酮醇的生長(zhǎng)抑制 IC 50值均高于 10μM。鑒于 TMFol 在體外腸細(xì)胞中的生長(zhǎng)抑制效力，其在Apc Min或 HCT116 異種移植小鼠模型中損害腫瘤發(fā)展的能力體內(nèi)被認(rèn)為值得研究。

TMFol 對(duì)Apc Min小鼠腺瘤發(fā)展的影響

Apc Min小鼠在飲食中接受了 0.2% 的 TMFol。在第 16 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在小鼠中觀察到的腺瘤負(fù)荷和數(shù)量反映了腫瘤的發(fā)展。消耗 TMFol 幾乎使小腸中的腺瘤負(fù)荷減半，盡管沒(méi)有影響結(jié)腸中的腺瘤負(fù)荷。圖 2A)。TMFol 并未顯著減少總腺瘤數(shù)量，但是當(dāng)單獨(dú)考慮小腸的近端部分時(shí)，TMFol 減少了腺瘤數(shù)量和負(fù)擔(dān)。圖 2B)。相反，對(duì)中段或遠(yuǎn)端小腸沒(méi)有顯著影響。終生接受 TMFol的Apc Min小鼠的體重與對(duì)照飲食的小鼠沒(méi)有區(qū)別(結(jié)果未顯示)。肺、肝、腎組織檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病理異常。這兩個(gè)觀察結(jié)果都初步表明 TMFol 沒(méi)有毒性。

圖 2:TMFol 的消耗對(duì)Apc Min小鼠的總小腸或結(jié)腸 (A) 和小腸分段 (B) 中腺瘤的負(fù)擔(dān) (頂部) 和數(shù)量 (底部) 的影響。小鼠從斷奶(第 4 周)到第 16 周被處死時(shí)接受 AIN93 飲食(對(duì)照)或含有 TMFol(0.2%)的 AIN93 飲食，并測(cè)量腺瘤數(shù)量和負(fù)擔(dān)。值是 n = 19(對(duì)照)或 21 只小鼠(TMFol)的平均值±SD。統(tǒng)計(jì)比較采用學(xué)生 t 檢驗(yàn)；條上方的 P 值表示 TMFol 和對(duì)照小鼠之間的顯著差異。

TMFol對(duì)MF1小鼠HCT116腫瘤生長(zhǎng)的影響

攜帶 HCT116 腺癌細(xì)胞的裸 MF1 小鼠在其飲食中接受了 0.2% 的 TMFol。每隔 2-3 天用卡尺測(cè)量腫瘤大小。腫瘤接種前一周服用 TMFol(“TMFol early”)在接種后第 16 天后將腫瘤大小減半(圖 3A)。在腫瘤接種后一周開(kāi)始使用 TMFol 進(jìn)行飲食干預(yù)(“TMFol 晚期”)僅具有很小但不顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。免疫組織化學(xué)研究了腫瘤組織中增殖或凋亡細(xì)胞的比例，分別通過(guò) Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 的染色來(lái)反映。Ki-67 是核仁的顆粒成分，僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)，用作人類腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物。與體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制功效一致，TMFol 顯著降低了 TMFol 早期方案小鼠 HCT116 腫瘤的細(xì)胞增殖，增殖指數(shù)為 72%，而對(duì)照小鼠的腫瘤增殖指數(shù)為 86%。圖 3B)。在 TMFol 晚期方案的小鼠中，腫瘤的增殖并未減少。與對(duì)照動(dòng)物相比，接受 TMFol 早期方案的小鼠腫瘤中凋亡細(xì)胞的腫瘤水平升高了 55%，而接受 TMFol 晚期方案的小鼠腫瘤中的細(xì)胞凋亡沒(méi)有增加。圖 3C)。

圖 3:TMFol 的消耗對(duì)裸 MF1 小鼠中 HCT116 腺癌異種移植物生長(zhǎng)的影響 (A)，以及對(duì) Ki-67 (B) 和切割的半胱天冬酶 3 (C) 染色所反映的 HCT116 腫瘤組織中的增殖和凋亡的影響。小鼠在前一周(A 中的正方形，B、C 中的“TMFol 早期”)或一周前接受對(duì)照飲食(A 中的菱形，B、C 中的“對(duì)照”)或含有 TMFol(0.2%)的飲食腫瘤接種后(A 中的三角形，B、C 中的“TMFol 晚期”)。通過(guò)卡尺測(cè)量 A 中的腫瘤體積(參見(jiàn)材料和方法)。B 和 C 顯示了 KI-67 (B) 或裂解的半胱天冬酶 3 (C) 染色為深棕色的腫瘤組織的顯微照片，柱反映了光密度讀數(shù)。請(qǐng)注意，在 B 坐標(biāo)中，從 60% 開(kāi)始。顯微照片(B，C)中的條為 50μm。

TMFol對(duì)腫瘤中p53表達(dá)的影響

在消耗了 TMFol 的Apc Min小鼠的腺瘤中，p53 的組織表達(dá)大約是對(duì)照小鼠中觀察到的水平的三倍。圖 4A)。類似地，在 TMFol 早期方案中，HCT116 荷瘤小鼠腫瘤組織中 p53 的表達(dá)比對(duì)照組中的表達(dá)增加了 50%。圖 4B)。相比之下，在 TMFol 晚期方案的小鼠腫瘤中，p53 表達(dá)與對(duì)照相比沒(méi)有顯著增加。與對(duì)照培養(yǎng)中的細(xì)胞相比，當(dāng)分別在 5 或 10μM 的 TMFol 中暴露 72 小時(shí)時(shí)，p53 在 APC10.1 和 HCT116 腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)也上調(diào)(圖 4C,D)。在初步實(shí)驗(yàn)中，暴露于 TMFol 的 HCT116 細(xì)胞顯示出與 p53 上調(diào)有效一致的生化變化。與對(duì)照相比，10μM 的 TMFol 顯著增加p21基因的表達(dá)，增加 3.2±1.2 倍，通過(guò)實(shí)時(shí) PCR 分析測(cè)量，和 p21 蛋白的表達(dá)，通過(guò)西方分析確定，增加 3.0±0.6 倍(兩者的 p<0.01)。此外，在用合適的熒光素酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的 HCT116 細(xì)胞中，TMFol 以濃度依賴性方式提高了 p53 靶蛋白 p21 和 Bax 的表達(dá)。圖 5)。

圖 4:p53 蛋白在Apc Min小鼠 (A) 的腺瘤中或在接受 TMFol (0.2%) 飲食的裸 MF1 小鼠 (B) 的 HCT116 腫瘤異種移植物中，以及在 APC10.1 (C) 或 HCT116 細(xì)胞 (D) 中的表達(dá)在收獲前將其暴露于指定濃度的 TMFol 72 小時(shí)。腫瘤組織獲自Apc Min (A) 或 HCT116 異種移植小鼠 (B)，如圖???2和3?

3. 3. 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析。條形反映條帶的光密度評(píng)估，值是 6(對(duì)照)和 12(TMFol)(A)或 14-15 只小鼠(B)和 3(C)或 4(D)獨(dú)立細(xì)胞暴露的平均值±SD實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份。具有適當(dāng) P 值的星號(hào)表示干預(yù)和控制之間的差異是顯著的，分析是通過(guò)學(xué)生 t 檢驗(yàn) (A) 或通過(guò)帶有事后 Bonferoni 校正的單向方差分析 (B、C、D)。

p53 蛋白在Apc Min小鼠 (A) 的腺瘤中或在接受 TMFol (0.2%) 飲食的裸 MF1 小鼠 (B) 的 HCT116 腫瘤異種移植物中以及在 APC10.1 (C) 或 HCT116 細(xì)胞 (D) 中表達(dá)在收獲前以指定濃度暴露于 TMFol 72 小時(shí)。腫瘤組織獲自Apc Min (A) 或 HCT116 異種移植小鼠 (B)，如圖 1 和圖2和3所述。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析。色譜柱，條帶的光密度評(píng)估；6 (對(duì)照) 和 12 (TMFol; A) 或 14 至 15 只小鼠 (B) 和 3 (C) 或 4 (D) 獨(dú)立細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)的平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份；酒吧，SD。帶有適當(dāng)P的星號(hào)值表明干預(yù)和控制之間的差異是顯著的。通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn) (A) 或通過(guò)帶有事后 Bonferoni 校正 (BD) 的單向方差分析進(jìn)行分析。

圖 5:TMFol 對(duì) HCT116 細(xì)胞中 p21-Luc (A) 和 Bax-Luc (B) 構(gòu)建體的熒光素酶報(bào)告基因活性的影響，其中已轉(zhuǎn)染了合適的螢火蟲(chóng)熒光素酶序列。值是3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD，星號(hào)表示值與對(duì)照顯著不同( P <0.01)。有關(guān)細(xì)胞和轉(zhuǎn)染的詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱材料和方法。

腫瘤組織中TMFol水平分析

中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組希望將 TMFol 在裸鼠中延緩 HCT116 腫瘤發(fā)展的能力與在靶組織中達(dá)到的藥劑水平聯(lián)系起來(lái)。在描述的功效實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)獲得腫瘤組織圖 3并進(jìn)行 HPLC 分析 (圖 6)。腫瘤中的 TMFol 水平為 146±80pmoles/g 組織(平均值±SD，n=6 只小鼠)，以摩爾濃度計(jì)為 146nM。當(dāng)將個(gè)體小鼠的 TMFol 水平與腫瘤負(fù)荷進(jìn)行比較時(shí)，未觀察到這兩個(gè)參數(shù)之間的相關(guān)性。

圖 6:HCT116 腫瘤異種移植組織提取物的代表性 HPLC 色譜圖，該提取物來(lái)自未使用 (A) 或添加了 TMFol (500ng/ml) (B) 的 AIN93G 飲食的小鼠，或在其一生中接受了強(qiáng)化 TMFol (0.2%) 的 AIN93G 飲食的小鼠( C)。有關(guān)色譜條件，請(qǐng)參見(jiàn)材料和方法。is=內(nèi)標(biāo)，即2′,5′,5,6,7,8-六甲氧基黃酮。

Ames 試驗(yàn)中 TMFol 缺乏致突變性

對(duì) TMFol 進(jìn)行 Ames 回復(fù)突變測(cè)定，以便在體外建立其誘變潛力。測(cè)試了沙門(mén)氏菌菌株 TA100、102 和 98，前者表明堿基對(duì)取代突變，后者表明移碼突變。在任何細(xì)菌培養(yǎng)中，無(wú)論是否存在大鼠肝臟代謝激活酶，TMFol 濃度高達(dá) 5mg/板都不會(huì)引起回復(fù)菌落頻率的任何明顯增加。表格1)。相反，合適的模型誘變劑，包括直接作用的基因毒物和需要代謝激活的化學(xué)物質(zhì)，都會(huì)導(dǎo)致預(yù)期的回復(fù)菌落增加。這些結(jié)果表明，所用濃度的 TMFol 在該系統(tǒng)中沒(méi)有致突變性。

表1:TMFol 在鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中的作用

消化道腫瘤中醫(yī)中藥消融方法及基因檢測(cè)討論

上述結(jié)果證明了對(duì)槲皮素分子支架進(jìn)行明智的結(jié)構(gòu)修飾可以產(chǎn)生在體外缺乏誘變活性并在體內(nèi)干擾小鼠結(jié)腸直腸癌發(fā)生的化合物。雖然槲皮素在一些口腔癌、宮頸癌、肺癌和結(jié)腸癌的臨床前模型中顯示出化學(xué)預(yù)防特性，但它缺乏預(yù)防Apc Min小鼠腺瘤發(fā)展的能力。甚至已經(jīng)證明，膳食濃度為 0.3-3% 的槲皮素會(huì)增加而不是抵消偶氮甲烷誘導(dǎo)的嚙齒動(dòng)物結(jié)腸異常隱窩和腺癌的形成 。此外，槲皮素的致突變性及其致癌性的有限證據(jù) (使其不太可能進(jìn)一步發(fā)展為癌癥化學(xué)預(yù)防劑。Fisetin 在 Ames 試驗(yàn) 中的致突變性低于槲皮素，但尚未在Apc Min中研究其延緩腺瘤發(fā)育的能力小鼠，盡管它已顯示出作為推定的前列腺癌化學(xué)預(yù)防劑的前景。TMFol(此處描述的黃酮醇)的合成受到兩個(gè)基本原理的指導(dǎo)：設(shè)計(jì)黃酮醇支架的致突變性并將結(jié)直腸癌化學(xué)預(yù)防特性賦予分子。后一種預(yù)期是基于以下觀察結(jié)果，即在結(jié)構(gòu)上與黃酮醇密切相關(guān)的黃酮中，與含羥基的對(duì)應(yīng)分子相比，在分子中包含甲氧基部分導(dǎo)致獲得更好的癌癥化學(xué)預(yù)防特性。例如，5,7-二甲氧基黃酮和 5,7,4'-三甲氧基黃酮說(shuō)明了甲氧基官能團(tuán)的存在對(duì)癌癥化學(xué)預(yù)防活性的益處，它們不僅在大鼠中的全身可用性方面優(yōu)于它們的羥基同源物，而且還能夠抑制口腔癌細(xì)胞增殖體外。此外，3',4',5',5,7-五甲氧基黃酮 (PMF) 和 tricin (4',5,7-trihydroxy- 3',5'-二甲氧基黃酮) 減少了Apc Min小鼠體內(nèi)的腺瘤發(fā)展，而芹菜素(4',5,7-三羥基黃酮)沒(méi)有。PMF 和 tricin在體外也比芹菜素更有效地抑制腺瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)暗示了甲氧基化黃酮在生長(zhǎng)抑制特性方面優(yōu)于羥基化黃酮的內(nèi)在優(yōu)勢(shì)。

與甲氧基部分在類黃酮中的化學(xué)預(yù)防增強(qiáng)作用一致，TMFol 在這里被證明可以在兩種小鼠模型中干擾腫瘤發(fā)生，并在體內(nèi)參與抗增殖和促凋亡機(jī)制。此處描述的研究選擇的膳食劑量相當(dāng)于每天約 240mg/kg。當(dāng)根據(jù)體表面積比較從小鼠外推至人類時(shí) ，該劑量為 720mg/m 2，因此每 80kg 人每天 1.4g，這是一個(gè)相當(dāng)大但可能可行的劑量。有趣的是，在Apc Min模型表明，TMFol 的腺瘤發(fā)展減少作用僅限于近端腸道。這種組織特異性可以說(shuō)是腸道部分之間 TMFol 水平差異的結(jié)果，其中 TMFol 濃度不足以在近端部分以外的腸道中活動(dòng)。中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組之前曾報(bào)道過(guò) C57BL6/J 小鼠(Apc Min背景菌株)胃腸道黏膜中 TMFol 的濃度，該菌株接受 TMFol 一周的飲食劑量與此處描述的Apc Min小鼠中使用的相同，為 220± 68 nmoles/g 組織，濃度為 220 μM 。這個(gè)值是 IC 50的 169 倍用于 TMFol 在 APC10.1 細(xì)胞中的生長(zhǎng)抑制，如此處所述。本研究未研究Apc Min小鼠腸粘膜中的 TMFol 水平，但可以假設(shè)它們與在 C57Bl6/J 小鼠中觀察到的非常相似。在這種情況下需要指出的是，在Apc Min中獲得的結(jié)果小鼠，作為人類結(jié)直腸癌發(fā)生的模型，需要謹(jǐn)慎解釋，因?yàn)樵撃Ｐ痛嬖谝恍┤秉c(diǎn)，特別是腫瘤發(fā)展主要發(fā)生在小腸，而不是像人類那樣發(fā)生在結(jié)腸的事實(shí)，并且在動(dòng)物垂死之前，腺瘤往往不會(huì)發(fā)展到癌的階段。HCT116 異種移植腫瘤和小鼠腸黏膜之間 TMFol 水平的巨大差異反映了藥劑通過(guò)前者的循環(huán)進(jìn)入組織，而后者組織中主要是未吸收的 TMFol。異種移植腫瘤中的 TMFol 水平僅為T(mén)MFol 介導(dǎo)的 HCT116 細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制IC 50的十五分之一，這表明 HCT116 腫瘤細(xì)胞在完整的動(dòng)物環(huán)境中在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，體內(nèi)對(duì) TMFol 的抗增殖作用比 HCT116 細(xì)胞更敏感。

上述結(jié)果表明，在兩種小鼠模型中，TMFol 消耗上調(diào)了腫瘤靶組織中野生型 p53 的表達(dá)，這種機(jī)制很可能有助于觀察到 TMFol 的化學(xué)預(yù)防功效。伴隨體外HCT116 細(xì)胞的初步結(jié)果表明，TMFol 上調(diào) p53 具有通過(guò)誘導(dǎo)下游啟動(dòng)子來(lái)判斷的功能性后果。引言中提到的 CP-31398  的研究為增加野生型 p53 的表達(dá)和激活減少Apc Min小鼠腸腺瘤發(fā)展的觀點(diǎn)提供了令人信服的支持，可能通過(guò)抑制腺瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。之前已經(jīng)描述了類黃酮在體外細(xì)胞中的 p53 調(diào)節(jié)能力，盡管據(jù)中醫(yī)中藥與抗腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物應(yīng)用研究重點(diǎn)課題組所知，類黃酮介導(dǎo)的完整動(dòng)物中 p53 的上調(diào)之前僅對(duì)黃酮芹菜素 (4' ,5,7-三羥基黃酮) 在攜帶 22Rv1 前列腺腫瘤異種移植物的小鼠中 。10μM 的 TMFol 在體外使 HCT116 細(xì)胞中 p53 蛋白的表達(dá)增加一倍，據(jù)報(bào)道非瑟酮具有類似的作用 。相比之下，高達(dá) 40μM 的槲皮素未能影響該細(xì)胞類型中 p53 的表達(dá)(，盡管它增加了 p53 磷酸化狀態(tài)。鑒于此處顯示的體外 APC1.10 細(xì)胞中三種黃酮醇的生長(zhǎng)抑制效力順序(TMFol>fisetin>槲皮素)，以及槲皮素在Apc Min小鼠中沒(méi)有活性的事實(shí)，這些差異在p53 調(diào)節(jié)效力初步暗示了 p53 上調(diào)與小鼠癌癥化學(xué)預(yù)防活性之間的機(jī)制聯(lián)系。如本文所述，TMFol 在Apc Min和 HCT116 異種移植模型中增加 p53 表達(dá)的機(jī)制仍有待闡明?；谂c CP-31398 的 p53 調(diào)節(jié)作用相關(guān)的文獻(xiàn)，這些機(jī)制可能很復(fù)雜并且依賴于模型。值得強(qiáng)調(diào)的是，TMFol 可能參與除 p53 調(diào)節(jié)以外的抗癌機(jī)制，這些機(jī)制需要在未來(lái)的研究中確定。

黃酮醇的誘變活性與分子支架 ( 環(huán) A 和 B 中的羥基部分有關(guān)，它們的甲基化降低了誘變活性 。與這些毒性結(jié)構(gòu)特征一致，TMFol 在 A 環(huán)中沒(méi)有羥基部分，在 B 環(huán)中沒(méi)有三個(gè)甲氧基，在 Ames 試驗(yàn)中顯示沒(méi)有誘變特性。此外，觀察到 TMFol 對(duì)小鼠體重或器官病理學(xué)沒(méi)有有害影響，這預(yù)示著它的安全性。然而，TMFol 的假定安全性需要在進(jìn)一步的臨床前實(shí)驗(yàn)中仔細(xì)闡明。

總之，這里描述的 TMFol 的特性支持這樣一種觀點(diǎn)，即基于現(xiàn)有的黃酮醇結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾，盡管很少，關(guān)于黃酮類結(jié)構(gòu)與化學(xué)預(yù)防活性或毒性之間關(guān)系的信息可能會(huì)產(chǎn)生有用的癌癥化學(xué)預(yù)防劑?？梢韵胂?，隨著對(duì)黃酮類重要分子靶點(diǎn)及其構(gòu)效關(guān)系的進(jìn)一步了解，黃酮醇的結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步優(yōu)化，超越TMFol。然而，鑒于此處描述的有利藥理學(xué)特征，TMFol 值得進(jìn)行額外的臨床前研究，以幫助判斷它是否值得推進(jìn)到臨床開(kāi)發(fā)階段。應(yīng)研究 TMFol 在其他嚙齒動(dòng)物致癌模型中的化學(xué)預(yù)防功效。

Preclinical colorectal cancer chemopreventive efficacy and p53-modulating activity of 3',4',5'-trimethoxyflavonol, a quercetin analogue.

Howells LM, Britton RG, Mazzoletti M, Greaves P, Broggini M, Brown K, Steward WP, Gescher AJ, Sale S.

Cancer Prev Res (Phila). 2010 Aug;3(8):929-39. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-09-0236. Epub 2010 Jul 13.

PMID: 20628003